修回日期: 2025-05-19
接受日期: 2025-07-01
在线出版日期: 2025-07-28
肠道疾病, 包括炎症性肠道疾病、结直肠癌以及肠易激综合征等, 严重影响患者的身心健康. 肠道是个复杂的生态系统, 传统的测序技术针对的是细胞群体, 难以对细胞异质性进行研究, 单细胞测序技术能够在单细胞层面对细胞基因组和转录组学等进行测序, 在揭示生物异质性等方面具有独特的优势, 有利于我们进一步揭示肠道疾病发生发展的机制. 本文就单细胞测序的基本步骤以及该技术在炎症性肠病、结直肠癌以及肠易激综合征等肠道疾病的应用现状作一述评, 以期更好地应用于肠道疾病的研究.
核心提要: 单细胞测序技术在肠道疾病的研究中有独特的优势, 能充分研究肠道细胞的异质性以及各种肠道疾病的发生发展机制, 为深入理解肠道疾病的本质提供前所未有的视角.
引文著录: 林佳漫, 侯秋科. 单细胞测序在肠道疾病中的应用现状. 世界华人消化杂志 2025; 33(7): 527-534
Revised: May 19, 2025
Accepted: July 1, 2025
Published online: July 28, 2025
Intestinal diseases, including inflammatory bowel disease (IBD), colorectal cancer (CRC), and irritable bowel syndrome (IBS), affect patients both physically and mentally. The intestine is a complex ecosystem, and traditional sequencing technologies, which target bulk cell populations, often fail to resolve cellular heterogeneity. Single-cell sequencing technology, however, enables genome-wide and transcriptomic analysis at the individual cell level, offering unique advantages in elucidating biological heterogeneity. This review focuses on the fundamental steps of single-cell sequencing and its recent applications in IBD, CRC, and IBS, aiming to provide insights for advancing research in intestinal diseases.
- Citation: Lin JM, Hou QK. Applications of single-cell sequencing in intestinal diseases. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2025; 33(7): 527-534
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v33/i7/527.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v33.i7.527
2009年Tang等[1]首次将单细胞转录组测序技术运用于小鼠的卵裂球和卵母细胞研究, 近十几年来该技术发展迅速, 已广泛运用于各种疾病的研究. 有别于传统的测序技术, 单细胞测序技术(single cell sequencing, SCS)能够在单个细胞的水平上对基因组、转录组以及表观遗传组进行高通量的测序, 从而帮助研究者识别单个细胞的类型、状态和分子特征, 为了解各种组织的细胞异质性、明确细胞间个基因之间的调控关系以及发现疾病相关新的细胞亚型带来新的研究思路[2,3]. SCS包括单细胞基因组测序、单细胞转录组测序、单细胞表观基因组测序以及单细胞蛋白组测序等, 其中, 单细胞转录组测序可以通过分析单个细胞内的mRNA表达情况, 发现细胞间的基因表达差异, 鉴定不同的细胞亚群, 绘制细胞分化轨迹等, 在各个领域应用最为广泛.
肠道作为人体消化系统的重要组成部分, 在发挥正常的生理功能时不可避免地受到了饮食、病原体等各种因素的影响而引发各种肠道疾病, 包括功能性肠道疾病, 如肠易激综合征、功能性消化不良等; 以及器质性肠道疾病, 如溃疡性结肠炎、结直肠肿瘤等[4]. 肠道疾病种类繁多, 给患者的身体健康和生活质量带来了很大的影响. 研究表明, 炎症性肠病在西方国家的发病率高且趋于稳定, 但在新兴工业化国家发病率迅速上升[5], 而结直肠癌是全球发病率第三、死亡率第二的高发肿瘤[6], 肠易激综合征为功能性肠病, 以腹痛、腹胀、排便次数及性状改变为主要特征, 这些肠道疾病给患病的家庭带来了沉重的经济负担和心理压力. 基于整体的高通量测序技术在肠道疾病的研究中取得了不少的进展[7-9], 但随着对肠道疾病研究的深入, 基于整体的高通量测序无法满足我们的科研需求, 因此基于单细胞水平的单细胞测序技术在肠道疾病的发病机制以及新治疗的相关靶点应用愈发广泛, 本文就单细胞测序技术在肠道疾病的应用现状作一述评.
近年来, 随着SCS的快速发展, 高通量测序技术能够实现对大量单细胞样本的自动化和快速分析, 正逐渐成为研究复杂生物组织的首选方法[10], 其关键技术环节涵盖了单细胞分离、核酸扩增、文库构建以及高通量测序. 每个环节都对最终的测序结果和数据分析有着极其重要的影响.
单细胞分离是SCS的基础且关键的步骤[11], 其核心目标在于确保组织样本能被精准解离为单个细胞, 从而为后续的核酸扩增和测序奠定坚实的基础. 目前已有不少先进的单细胞分离技术. 例如, 荧光激活细胞分选基于流式细胞术, 通过细胞表面标志物的荧光标记结合流式细胞仪实现单细胞分选, 纯度高且效率高, 适合已知表型的细胞亚群分离[11,12], 激光捕获显微切割技术能够在显微镜下观察分辨出目标组织或细胞, 通过激光从异质组织或者细胞样品中对目标区域进行精准切割, 收集目标样本[13,14]. 免疫磁珠分离[15]则借助与细胞表面抗原特异性结合的磁珠, 在磁场作用下实现对目标细胞的分离, 且对细胞损伤较小, 广泛用于分离和纯化特定类型的细胞, 如免疫细胞、肿瘤细胞等. 此外, 新兴的微流控技术在单细胞分离领域展现出巨大潜力. 微流控芯片能够精确操控微小体积的流体, 实现单细胞的高效捕获、分选和封装, 具有高通量、高灵敏度和高集成化等优点, 为单细胞测序技术的发展带来了新的契机[16,17]. 例如, 基于液滴微流控的单细胞分离方法, 能够将单个细胞包裹在微小的液滴中, 实现对大量单细胞的并行处理和精准识别, 大大提高了单细胞分离的通量和效率[18].
由于单个细胞中的核酸含量较少, 因此需要对全基因组或转录组进行扩增以满足测序需求. 以全基因组为例, 常用的扩增方法包括多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)、简并寡核苷酸引发的聚合酶链反应、多重退火和基于环的扩增循环[19], 其中MDA是对整个基因组覆盖最广, 各位点扩增偏移最小的扩增方法[20], 应用最为广泛. 该技术利用随机引物和具有链置换活性的DNA聚合酶, 能够在恒温条件下对全基因组DNA进行高效扩增, 其扩增具有高效性和高保真性, 且扩增长度和产量稳定, 能够较为全面地反映原始基因组的信息[21]. 转录组扩增则需要将细胞中的mRNA反转录为cDNA后再进行扩增, 常用的转录组扩增方法包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、体外转录以及模板置换等. PCR是常用的一种DNA扩增技术, 利用引物与cDNA的特异性结合, 通过扩增循环实现对转录本的大量扩增, 具有操作简单、扩增效率高的特点. 近年来, SMART扩增技术[22]以及10×genomics技术等发展迅速, 进一步提高了核酸扩增的准确性和可靠性.
扩增后的核酸需要构建适合测序的文库, 构建过程中会在核酸片段两端添加特定的接头序列, 便于在测序平台进行固定和测序. 将构建好的文库进行高通量测序, 这种方法可以在短时间内对数百万个DNA分子进行测序, 按测序原理可将不同的测序平台分为微流控液滴法、微孔板以及微流控芯片法等, 每一种都具有独特的技术原理和优势. 微流控液滴法自动化程度高, 成本较低, 但比较依赖细胞活性, 代表性平台有10×Genomics Chromium、Drop-seq等, 微孔板法的特点是可以将细胞分离可视化, 适合低通量、高纯度需求的单细胞研究, 代表性平台有Smart-seq2、CEL-Seq2等, 微流控芯片法结合了微孔与液滴的优势, 集成度高, 代表性平台有Fluidigm C1、Mission Bio Tapestri等. 此外, 还有其他的测序平台和技术也在不断发展, 如基于半导体技术的测序平台, 通过检测DNA合成过程中释放的氢离子来测定DNA序列, 具有快速、低成本的特点, 为单细胞测序技术的进一步发展和应用提供了更多的选择.
SCS能够深入研究细胞间的异质性, 对于复杂的肠道系统是个强大的研究工具. 人体的肠道系统功能复杂, 具有消化、吸收、分泌以及免疫等多种功能, 上皮细胞、免疫细胞、神经细胞等不同细胞之间相互协调对维持肠道功能至关重要. David等[23]通过单细胞RNA测序以及空间转录组学分析对17个个体胚胎的77个肠道样本进行研究, 鉴定出101中细胞状态, 涵盖了上皮和间充质祖细胞群等, 明确隐窝 - 绒毛轴形成、神经、血管、间充质形态发生及免疫细胞群体的发育过程, 构建了肠道的发育时空图谱. 通过scRNA-seq, 研究人员发现了多种新的肠道细胞亚型, 如在人类结肠中发现了BEST4肠上皮细胞, 其富含负责ph感知和电解质运输的基因[24]. 此外, 还发现了杯状细胞的多种细胞亚群, 包括隐窝间杯状细胞等[25,26].
炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组慢性、复发性的肠道炎症性疾病, 具有高度的异质性, 利用SCS可以研究细胞类型以及发病机制. IBD根据组织学、影像学以及临床特征, 通常分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD)[27]. Mitsialis等[28]利用CyTOF分析、scRNA-seq等技术研究UC与CD患者结肠和血液中的免疫细胞, 发现二者在免疫细胞特征以及疾病相关细胞因子表达等存在显著差异, 揭示了UC与CD的独特免疫细胞特征. 研究发现UC以黏膜IL-17A+效应记忆T细胞、CXCR3+浆母细胞及非典型粒细胞扩增为特征, 而CD则表现为IL-1β+单核细胞/树突状细胞和幼稚B细胞富集. 研究还发现CD患者外周血IL-1β信号通路激活更显著, 而UC的Treg细胞亚群呈现IL-17A+非抑制性表型, 为疾病分型及靶向治疗提供了新依据.
SCS还用于对IBD发病机制的研究当中, 微生物和肠道免疫系统之间的相互作用失调是引起CD慢性炎症的重要机制之一[29]. 通过多种单细胞测序技术, 从成人重症CD患者回肠末端的上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes, IEL)和固有层(lamina propria, LP)的T细胞中发现了IEL包含多种独特的T细胞亚群, 如表达RORγt和白细胞介素-26的NKp30+γδT 细胞. 与健康对照相比, CD患者IEL中激活的TH17细胞增加, CD8+T、TFH和Treg细胞减少; LP中CD8+和TH17细胞增加, CD4+T细胞减少且Treg和TFH比例降低. 这些变化可能跟CD患者肠道节段跨壁炎症相关. 除此之外, 肠粘膜在IBD的发病机制也起着核心作用, IBD的发生与肠道粘膜的损伤有关, Frede等[30]采用scRNA-seq以及空间转录组学等技术对利用DSS诱导的小鼠结肠炎模型和柠檬酸杆菌感染模型进行研究, 结果发现B细胞在肠道损伤修复的过程中大量扩增, 阻碍了基质-上皮细胞间的相互作用, 不利于肠道粘膜的愈合, 为IBD的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据. 同时, 有学者发现肠道微生物与IBD的发生发展关系密切. 脆弱拟杆菌是人体肠道的正常菌群成员之一, 而产毒素脆弱拟杆菌(enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF)是其中的一个亚型, 能够分泌肠毒素参与肠道疾病的发生发展, 有学者通过单细胞测序等多项技术对其进行研究[31], 结果发现ETBF可以通过分泌肠毒素抑制FOXD3, 下调METTL3介导的m6A修饰, 进而通过抑制YTHDF2依赖的mRNA降解增加ITGA5的表达, 激活炎症巨噬细胞, 促进IBD的发展, 而单细胞测序结果显示ETBF富集患者肠道炎症巨噬细胞比例升高, 且其分泌的脆弱拟杆菌毒素诱导的m6A修饰异常可通过靶向ITGA5(如抑制剂Cilengitide)来缓解小鼠结肠炎症状, 为IBD提供了微生物-表观调控新机制及治疗靶点.
肠道黏膜屏障功能受损可以使肠道通透性增加, 促进肠腔内容物的暴露, 从而引发肠道炎症的免疫学反应. 而抗TNF-α治疗可以减轻患者的黏膜炎症并恢复患者的肠道通透性[32]. 但约40%的患者对治疗无响应或者未能持续缓解[33]. Wang等[34]利用单细胞RNA测序技术, 发现结肠中Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂SPINK4在结肠炎中表达上调, 并与疾病进展动态相关. 通过重组小鼠的SPINK4能显著特异性敲除SPINK4小鼠的疾病状态, 并与现有的TNF-α抑制剂英夫利昔单抗具有协同治疗作用, 为临床治疗IBD发现潜在的治疗靶点. 而Zheng等[35]通过单细胞测序数据, 阐明了S1PR1激动剂SAR247799能够恢复肠道内皮屏障的完整性, 缓解IBD的发生和发展, 展现出了在结肠炎治疗中的巨大潜力.
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球发病率第三、死亡率第二的消化系统恶性肿瘤[6], 具有高发病率和高死亡率的特点, 五年的相对生存率仅为64.7%[36], 若是伴随着转移的话还会更低. 传统研究方法难以深入解析肿瘤细胞的异质性以及肿瘤微环境中细胞间的复杂相互作用. 而单细胞测序技术能够在单细胞水平对基因组、转录组、表观组等进行测序分析, 在结直肠癌的多个领域, 如癌前病变、肿瘤来源、肿瘤细胞异质性、肿瘤免疫治疗、肿瘤微环境和肿瘤转移等均取得了不少的进展.
对于结直肠癌而言, 提高肠癌早诊率有利于阻断癌症的进展过程. 结直肠癌存在着明确的癌前病变阶段, 即正常细胞演变到肿瘤细胞并获得恶性生物学行为的过程-息肉腺瘤期[37]. 癌前常规腺瘤以及无蒂锯齿状腺瘤/息肉可以发展CRC分类中的微卫星稳定型以及微卫星高度不稳定型[38], Chen等[38]通过多组学分析, 发现腺瘤源于WNT驱动的干细胞扩增, 锯齿状息肉则由分化细胞经胃化生而来. 在恶性进展中, 微卫星不稳定的结直肠癌获得干细胞特性, 且肿瘤内存在异质性. 免疫微环境方面, 锯齿状息肉在超突变前就与细胞毒性免疫环境相关, 肿瘤细胞的分化状态影响免疫微环境. 该研究为理解结直肠息肉的恶性进展提供了多组学视角, 有助于制定精准的监测和预防策略.
肿瘤异质性对于结直肠癌的发生发展以及治疗预后等方面都有着极其重要的作用. 它是指肿瘤细胞在生长过程中, 在细胞形态、基因、蛋白表达及功能等方面呈现出的差异. 肿瘤细胞群体在扩增过程中会产生遗传和表型差异, 基于此, Roerink等[39]通过构建类器官模型, 并对其进行全基因组测序、RNA测序等, 发现癌细胞的体细胞突变数远多于正常细胞, 且肿瘤内除了突变多样化, 还存在甲基化状态、转录组状态和药物反应的多样化, 可能与癌症基因的驱动突变有关, 探究肿瘤内的多样化为理解结直肠癌的发生发展和治疗提供了重要的依据. Wang等[40]利用单细胞测序分析18例CRC患者的原发肿瘤、肝转移灶以及癌旁租住的免疫和非免疫细胞, 结果显示T细胞在肿瘤中以激活和增殖状态为主, 在肝转移灶中存在低活性HSP+T细胞; B细胞在早期肿瘤中呈前B细胞样表达抑癌基因, 晚期则分化为IgA+IGLC2+浆细胞且与预后不良相关, 揭示了结直肠癌不同区域的肿瘤细胞在转录差异, 研究还表明髓系细胞可以通过配体-受体互作调控T细胞功能, CCL8+循环B细胞与CCR5+ T细胞互作可能增强抗肿瘤免疫功能, 有助于深入了解肿瘤的发展和转移机制, 也有助于CRC的个性化免疫治疗.
肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的持续相互作用在肿瘤的起始、进展、转移和对治疗的反应中起着决定性作用[41]. Lee等[42]通过单细胞RNA测序全面探索了结直肠癌的细胞景观和细胞间相互作用网络, 研究显示: 正常肠黏膜中以IgA型体液免疫和γδT细胞驱动的先天免疫为主, 而结直肠癌中则转变为以SPP1+巨噬细胞和Treg细胞富集为特征的抑制性细胞免疫. 肿瘤细胞处于细胞相互作用网络的中心, 其遗传改变在塑造肿瘤微环境中起重要作用, 揭示了肿瘤细胞遗传改变、基质细胞和免疫细胞对肿瘤微环境的影响. 癌症免疫疗法是晚期癌症的重要治疗手段, Kim等[43]利用单细胞RNA测序对肿瘤浸润淋巴细胞进行研究, 发现CD73和PD-1抑制剂对肿瘤免疫微环境的调节作用存在差异. CD73抑制剂AB680可改善免疫抑制细胞(如Treg和耗竭T细胞)的功能, 而PD-1阻断剂能增加Entpd1阴性T细胞和Pdcd1阳性T细胞的TCR多样性, 二者联合治疗可能更有效地抑制肿瘤生长, 为结直肠癌免疫治疗的发展提供了新的思路和潜在靶点, 未来需要通过生物标志物筛选、剂量优化及联合其他疗法进一步挖掘其临床潜力, 推动结直肠癌的精准治疗.
目前单细胞测序技术在肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)的应用较少. 肠易激综合征是一种常见的肠道功能性疾病, 临床上以腹部不适以及排便性状改变为主要症状[44], 根据罗马IV诊断标准可将其分为四个亚型[45], 以腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome with diarrhea, IBS-D)最为常见. 目前关于IBS的确切病因及发病机制尚未明确, 共识认为多与各种因素引起的"脑-肠轴"失调导致的相应病理生理机制的改变相关, 其中精神因素在IBS的发展和恶化中起着非常重要的作用[44]. Zhang等[46]通过单细胞RNA测序技术、宏基因组学等多种技术对临床样本以及动物模型样本进行研究发现, 压力促使CD4+T细胞产生过多黄嘌呤(Xan), Xan作用于肠道的AdorA2B受体, 促进血红蛋白释放, 进而导致肠道内L. murinus菌异常增殖. L. murinus产生的亚精胺抑制浆细胞样树突状细胞中1型干扰素的表达, 使得结肠平滑肌细胞收缩功能失调, 最终引发IBS-D症状. 该研究揭示了压力诱发IBS-D的机制, 为其治疗提供了新靶点和理论依据.
当前对于肠易激综合征的治疗效果不佳, 临床上西医多以对症治疗为主, 长期使用毒副作用明显, 而中医药在治疗IBS上有独特的优势, 大量研究结果显示中医药能有效改善IBS患者腹痛以及腹泻等临床症状[47-49]. 赵兴杰[50]围绕痛泻安肠方治疗腹泻型肠易激综合征展开了临床及基础研究. 临床研究方面, 先对对健康人及患者的外周血进行测序分析, 发现IBS-D患者外周血中有5类免疫细胞发生变化, CD8+NKT、NK、CD4+CMT、免疫B细胞以及CD56hiCD62L+NK细胞, 且差异基因功能富集在免疫、感染及炎症相关通路, 表明IBS-D患者的免疫谱较健康人发生了明显的变异, 接着对应用痛泻安肠方的患者前后的外周血进行单细胞测序分析, 结果表明治疗前后的外周血单细胞水平变化可能与CD4+CMT细胞、Treg细胞、NK细胞、CD56hiCD62l+NK细胞以及免疫B细胞这五类细胞相关, 其中Treg在上一步研究中未见, 提示痛泻安肠方可能通过上调Treg细胞的比例来进行相关的治疗调节, 并通过设计动物实验来炎症痛泻安肠方对IBS-D小鼠的治疗效果. 该实验是首次在单细胞水平上研究中医药调控腹泻型肠易激综合征的免疫学机制, 为我们阐明中医药治疗IBS的作用靶点及途径提供新的研究思路. Chen等[51]通过单细胞转录组测序等多组学技术结合生物信息分析以及动物实验, 发现中药广藿香中的有效成分广藿香醇(patchouli alcohol, PA)可以通过调节肌球蛋白Va(Myosin Va)介导的神经递质释放, 修复IBS-D大鼠的肠道神经稳态. 机制上, PA通过上调Myosin Va表达, 促进抑制性神经递质(如NO、VIP)释放, 减少兴奋性神经递质(如ACh、SP)过度释放, 同时改善肠道菌群失调(如增加乳杆菌丰度). 在慢性束缚应激诱导的IBS-D大鼠模型中, PA(5-20 mg/kg)显著缓解腹痛、腹泻症状, 恢复结肠纵肌肌间神经丛的神经元平衡, 且在Myosin Va缺陷小鼠中验证了其作用依赖于Myosin Va的存在. 该实验不仅证实了广藿香醇改善肠道菌群紊乱的分子机制, 还为开发新型靶向药物提供了理论依据.
先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HSCR)是小儿外科常见的先天性肠道畸形疾病, 是引起功能性肠梗阻的主要原因. He等[52]收集了来自7名HSCR患者的8个无神经节病变肠组织和来自这些患者的5个正常肠组织, 以及7名正常人的26个健康肠组织, 通过单细胞RNA测序发现HSCR无神经节段存在肠道纤维化表型, 表现为成纤维细胞和肌成纤维细胞数量增加且病变更早, 激活数量越多, 细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相关基因(如COL1A1、FN1、LAMA2)和纤维化调节因子(POSTN、ANXA1、HSP70)表达上调, 转录因子NR2F1在成纤维细胞和神经胶质细胞中高表达并调控ECM形成. 研究提示抗纤维化治疗可能预防HSCR相关肠结肠炎、缓解肠狭窄并改善细胞治疗效果, 为HSCR发病机制和治疗提供新方向.
SCS还用于新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)的研究当中. NEC是新生儿时期最常见的胃肠道急症, 有着较高的病死率, 可高达20%-30%[53]. 肠道免疫细胞群体的异质性与NEC的发病机制与治疗息息相关. Adi等[54]通过单细胞RNA测序、T细胞受体分析和成像技术, 构建了NEC的单细胞图谱, 发现NEC肠组织中促炎巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞显著增加, T细胞克隆扩增增强, 绒毛顶端上皮细胞减少且剩余上皮细胞上调促炎基因. 揭示了NEC中上皮-间充质-免疫细胞的异常相互作用, 如血管内皮细胞与免疫细胞通过VCAM1-ITGB1等配体-受体对相互作用, 并发现抗纤维化和调节T细胞功能可能成为治疗靶点. Olaloye等[55]在NEC患儿的肠道组织中鉴定出了特异性的CD16+CD163+单核与巨噬细胞, 这类细胞高表达炎症基因(如TREM1、IL1A、IL1B)和中性粒细胞招募因子(如IL8、CXCL1), 并与血管相邻, 提示其从外周迁移至炎症部位. 此外, NEC肠黏膜中存在三种中性粒细胞表型(未成熟、衰老、新迁移), 其中新迁移中性粒细胞与CD16+CD163+单核细胞高度相关. 研究表明该单核细胞亚群可能成为NEC的生物标志物和治疗靶点.
单细胞测序技术的快速发展为我们研究肠道疾病提供了新的研究思路和选择, 在炎症性肠病、结直肠癌等肠道疾病的发生发展等方面获得了不少进展. 但是目前单细胞测序技术还面临着不少亟待解决的问题. 由于SCS的成本以及数据分析技术的复杂性, 限制了其大规模应用. 在实际操作也会遇到各种各样的挑战, 比如在单细胞分离过程中会丢失部分细胞群, 还有可能对细胞造成损伤, 因此影响细胞的活性和核酸质量, 导致部分细胞无法进行有效测序. 此外对于一些肠道罕见细胞亚群或低丰度细胞的分离仍然存在困难, 其分离效率以及纯度都有待提高. 目前多组学技术, 如将单细胞转录组测序技术与空间转录组学、代谢组学等结合, 可以弥补单一技术的局限性, 还能从不同时空维度分析肠道细胞动态变化. 此外, 开发低成本、高通量的一体化实验平台、优化单细胞分离、捕获等相关技术也有助于探索肠道相关疾病的发展机制, 随着技术更新与多组学结合的深入, 单细胞测序技术必将为肠道疾病的诊疗带来更有革命性的突破.
学科分类: 胃肠病学和肝病学
手稿来源地: 广东省
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科学编辑: 刘继红 制作编辑:郑晓梅
| 1. | Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, Wang X, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao K, Surani MA. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6:377-382. [PubMed] [DOI] |
| 2. | Lei Y, Tang R, Xu J, Wang W, Zhang B, Liu J, Yu X, Shi S. Applications of single-cell sequencing in cancer research: progress and perspectives. J Hematol Oncol. 2021;14:91. [PubMed] [DOI] |
| 3. | Hamey FK, Lau WWY, Kucinski I, Wang X, Diamanti E, Wilson NK, Göttgens B, Dahlin JS. Single-cell molecular profiling provides a high-resolution map of basophil and mast cell development. Allergy. 2021;76:1731-1742. [PubMed] [DOI] |
| 4. | Guo Y, Ren C, He Y, Wu Y, Yang X. Deciphering the spatiotemporal transcriptional landscape of intestinal diseases (Review). Mol Med Rep. 2024;30:157. [PubMed] [DOI] |
| 5. | Ng SC, Shi HY, Hamidi N, Underwood FE, Tang W, Benchimol EI, Panaccione R, Ghosh S, Wu JCY, Chan FKL, Sung JJY, Kaplan GG. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 2017;390:2769-2778. [PubMed] [DOI] |
| 6. | Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209-249. [PubMed] [DOI] |
| 7. | Nayfach S, Páez-Espino D, Call L, Low SJ, Sberro H, Ivanova NN, Proal AD, Fischbach MA, Bhatt AS, Hugenholtz P, Kyrpides NC. Metagenomic compendium of 189,680 DNA viruses from the human gut microbiome. Nat Microbiol. 2021;6:960-970. [PubMed] [DOI] |
| 8. | Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium. The Integrative Human Microbiome Project. Nature. 2019;569:641-648. [PubMed] [DOI] |
| 9. | Han L, Zhao L, Zhou Y, Yang C, Xiong T, Lu L, Deng Y, Luo W, Chen Y, Qiu Q, Shang X, Huang L, Mo Z, Huang S, Huang S, Liu Z, Yang W, Zhai L, Ning Z, Lin C, Huang T, Cheng C, Zhong LLD, Li S, Bian Z, Fang X. Altered metabolome and microbiome features provide clues in understanding irritable bowel syndrome and depression comorbidity. ISME J. 2022;16:983-996. [PubMed] [DOI] |
| 10. | Li Y, Wang Q, Xuan Y, Zhao J, Li J, Tian Y, Chen G, Tan F. Investigation of human aging at the single-cell level. Ageing Res Rev. 2024;101:102530. [PubMed] [DOI] |
| 11. | Slovin S, Carissimo A, Panariello F, Grimaldi A, Bouché V, Gambardella G, Cacchiarelli D. Single-Cell RNA Sequencing Analysis: A Step-by-Step Overview. Methods Mol Biol. 2021;2284:343-365. [PubMed] [DOI] |
| 12. | Cai Y, Wang J, Zou K. The Progresses of Spermatogonial Stem Cells Sorting Using Fluorescence-Activated Cell Sorting. Stem Cell Rev Rep. 2020;16:94-102. [PubMed] [DOI] |
| 13. | Datta S, Malhotra L, Dickerson R, Chaffee S, Sen CK, Roy S. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 2015;30:1255-1269. [PubMed] [DOI] |
| 14. | Aguilar-Bravo B, Sancho-Bru P. Laser capture microdissection: techniques and applications in liver diseases. Hepatol Int. 2019;13:138-147. [PubMed] [DOI] |
| 16. | Gebreyesus ST, Muneer G, Huang CC, Siyal AA, Anand M, Chen YJ, Tu HL. Recent advances in microfluidics for single-cell functional proteomics. Lab Chip. 2023;23:1726-1751. [PubMed] [DOI] |
| 17. | Prakadan SM, Shalek AK, Weitz DA. Scaling by shrinking: empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nat Rev Genet. 2017;18:345-361. [PubMed] [DOI] |
| 18. | Ding Y, Howes PD, deMello AJ. Recent Advances in Droplet Microfluidics. Anal Chem. 2020;92:132-149. [PubMed] [DOI] |
| 20. | Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102. [PubMed] [DOI] |
| 22. | Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR, Daniels GA, Khrebtukova I, Loring JF, Laurent LC, Schroth GP, Sandberg R. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 2012;30:777-782. [PubMed] [DOI] |
| 23. | Fawkner-Corbett D, Antanaviciute A, Parikh K, Jagielowicz M, Gerós AS, Gupta T, Ashley N, Khamis D, Fowler D, Morrissey E, Cunningham C, Johnson PRV, Koohy H, Simmons A. Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution. Cell. 2021;184:810-826.e23. [PubMed] [DOI] |
| 24. | Parikh K, Antanaviciute A, Fawkner-Corbett D, Jagielowicz M, Aulicino A, Lagerholm C, Davis S, Kinchen J, Chen HH, Alham NK, Ashley N, Johnson E, Hublitz P, Bao L, Lukomska J, Andev RS, Björklund E, Kessler BM, Fischer R, Goldin R, Koohy H, Simmons A. Colonic epithelial cell diversity in health and inflammatory bowel disease. Nature. 2019;567:49-55. [PubMed] [DOI] |
| 25. | Nyström EEL, Martinez-Abad B, Arike L, Birchenough GMH, Nonnecke EB, Castillo PA, Svensson F, Bevins CL, Hansson GC, Johansson MEV. An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function. Science. 2021;372:eabb1590. [PubMed] [DOI] |
| 26. | Haber AL, Biton M, Rogel N, Herbst RH, Shekhar K, Smillie C, Burgin G, Delorey TM, Howitt MR, Katz Y, Tirosh I, Beyaz S, Dionne D, Zhang M, Raychowdhury R, Garrett WS, Rozenblatt-Rosen O, Shi HN, Yilmaz O, Xavier RJ, Regev A. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 2017;551:333-339. [PubMed] [DOI] |
| 27. | Garrido-Trigo A, Corraliza AM, Veny M, Dotti I, Melón-Ardanaz E, Rill A, Crowell HL, Corbí Á, Gudiño V, Esteller M, Álvarez-Teubel I, Aguilar D, Masamunt MC, Killingbeck E, Kim Y, Leon M, Visvanathan S, Marchese D, Caratù G, Martin-Cardona A, Esteve M, Ordás I, Panés J, Ricart E, Mereu E, Heyn H, Salas A. Macrophage and neutrophil heterogeneity at single-cell spatial resolution in human inflammatory bowel disease. Nat Commun. 2023;14:4506. [PubMed] [DOI] |
| 28. | Mitsialis V, Wall S, Liu P, Ordovas-Montanes J, Parmet T, Vukovic M, Spencer D, Field M, McCourt C, Toothaker J, Bousvaros A; Boston Children's Hospital Inflammatory Bowel Disease Center; Brigham and Women's Hospital Crohn's and Colitis Center, Shalek AK, Kean L, Horwitz B, Goldsmith J, Tseng G, Snapper SB, Konnikova L. Single-Cell Analyses of Colon and Blood Reveal Distinct Immune Cell Signatures of Ulcerative Colitis and Crohn's Disease. Gastroenterology. 2020;159:591-608.e10. [PubMed] [DOI] |
| 29. | Jaeger N, Gamini R, Cella M, Schettini JL, Bugatti M, Zhao S, Rosadini CV, Esaulova E, Di Luccia B, Kinnett B, Vermi W, Artyomov MN, Wynn TA, Xavier RJ, Jelinsky SA, Colonna M. Single-cell analyses of Crohn's disease tissues reveal intestinal intraepithelial T cells heterogeneity and altered subset distributions. Nat Commun. 2021;12:1921. [PubMed] [DOI] |
| 30. | Frede A, Czarnewski P, Monasterio G, Tripathi KP, Bejarano DA, Ramirez Flores RO, Sorini C, Larsson L, Luo X, Geerlings L, Novella-Rausell C, Zagami C, Kuiper R, Morales RA, Castillo F, Hunt M, Mariano LL, Hu YOO, Engblom C, Lennon-Duménil AM, Mittenzwei R, Westendorf AM, Hövelmeyer N, Lundeberg J, Saez-Rodriguez J, Schlitzer A, Das S, Villablanca EJ. B cell expansion hinders the stroma-epithelium regenerative cross talk during mucosal healing. Immunity. 2022;55:2336-2351.e12. [PubMed] [DOI] |
| 31. | Yan Y, Tian L, Zhao Y, Xuan B, Xu X, Ding J, Li W, Zhou YL, Zhang Y, Ma Y, Ning L, Wang Z, Jiang Y, Zhu X, Huang X, Hu M, Shen N, Gao X, Fang JY, Cui Z, Cao Z, Chen H, Wang X, Hong J. Bacteroides fragilis Toxin Suppresses METTL3-Mediated m6A Modification in Macrophage to Promote Inflammatory Bowel Disease. J Crohns Colitis. 2025;19:jjae179. [PubMed] [DOI] |
| 32. | Michielan A, D'Incà R. Intestinal Permeability in Inflammatory Bowel Disease: Pathogenesis, Clinical Evaluation, and Therapy of Leaky Gut. Mediators Inflamm. 2015;2015:628157. [PubMed] [DOI] |
| 33. | Thomas T, Friedrich M, Rich-Griffin C, Pohin M, Agarwal D, Pakpoor J, Lee C, Tandon R, Rendek A, Aschenbrenner D, Jainarayanan A, Voda A, Siu JHY, Sanches-Peres R, Nee E, Sathananthan D, Kotliar D, Todd P, Kiourlappou M, Gartner L, Ilott N, Issa F, Hester J, Turner J, Nayar S, Mackerodt J, Zhang F, Jonsson A, Brenner M, Raychaudhuri S, Kulicke R, Ramsdell D, Stransky N, Pagliarini R, Bielecki P, Spies N, Marsden B, Taylor S, Wagner A, Klenerman P, Walsh A, Coles M, Jostins-Dean L, Powrie FM, Filer A, Travis S, Uhlig HH, Dendrou CA, Buckley CD. A longitudinal single-cell atlas of anti-tumour necrosis factor treatment in inflammatory bowel disease. Nat Immunol. 2024;25:2152-2165. [PubMed] [DOI] |
| 34. | Wang Y, Han J, Yang G, Zheng S, Zhou G, Liu X, Cao X, Li G, Zhang B, Xie Z, Li L, Zhang M, Li X, Chen M, Zhang S. Therapeutic potential of the secreted Kazal-type serine protease inhibitor SPINK4 in colitis. Nat Commun. 2024;15:5874. [PubMed] [DOI] |
| 35. | Zheng H, Yu J, Gao L, Wang K, Xu Z, Zeng Z, Zheng K, Tang X, Tian X, Zhao Q, Zhao J, Wan H, Cao Z, Zhang K, Cheng J, Brosius J, Zhang H, Li W, Yan W, Shao Z, Luo F, Deng C. S1PR1-biased activation drives the resolution of endothelial dysfunction-associated inflammatory diseases by maintaining endothelial integrity. Nat Commun. 2025;16:1826. [PubMed] [DOI] |
| 36. | Bray F, Laversanne M, Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Soerjomataram I, Jemal A. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74:229-263. [PubMed] [DOI] |
| 38. | Chen B, Scurrah CR, McKinley ET, Simmons AJ, Ramirez-Solano MA, Zhu X, Markham NO, Heiser CN, Vega PN, Rolong A, Kim H, Sheng Q, Drewes JL, Zhou Y, Southard-Smith AN, Xu Y, Ro J, Jones AL, Revetta F, Berry LD, Niitsu H, Islam M, Pelka K, Hofree M, Chen JH, Sarkizova S, Ng K, Giannakis M, Boland GM, Aguirre AJ, Anderson AC, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, Hacohen N, Kawasaki K, Sato T, Goettel JA, Grady WM, Zheng W, Washington MK, Cai Q, Sears CL, Goldenring JR, Franklin JL, Su T, Huh WJ, Vandekar S, Roland JT, Liu Q, Coffey RJ, Shrubsole MJ, Lau KS. Differential pre-malignant programs and microenvironment chart distinct paths to malignancy in human colorectal polyps. Cell. 2021;184:6262-6280.e26. [PubMed] [DOI] |
| 39. | Roerink SF, Sasaki N, Lee-Six H, Young MD, Alexandrov LB, Behjati S, Mitchell TJ, Grossmann S, Lightfoot H, Egan DA, Pronk A, Smakman N, van Gorp J, Anderson E, Gamble SJ, Alder C, van de Wetering M, Campbell PJ, Stratton MR, Clevers H. Intra-tumour diversification in colorectal cancer at the single-cell level. Nature. 2018;556:457-462. [PubMed] [DOI] |
| 40. | Wang W, Zhong Y, Zhuang Z, Xie J, Lu Y, Huang C, Sun Y, Wu L, Yin J, Yu H, Jiang Z, Wang S, Wang C, Zhang Y, Huang Y, Han C, Zhong Z, Hu J, Ouyang Y, Liu H, Yu M, Wei X, Chen D, Huang L, Hou Y, Lin Z, Liu S, Ling F, Yao X. Multiregion single-cell sequencing reveals the transcriptional landscape of the immune microenvironment of colorectal cancer. Clin Transl Med. 2021;11:e253. [PubMed] [DOI] |
| 41. | Xiao Y, Yu D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol Ther. 2021;221:107753. [PubMed] [DOI] |
| 42. | Lee HO, Hong Y, Etlioglu HE, Cho YB, Pomella V, Van den Bosch B, Vanhecke J, Verbandt S, Hong H, Min JW, Kim N, Eum HH, Qian J, Boeckx B, Lambrechts D, Tsantoulis P, De Hertogh G, Chung W, Lee T, An M, Shin HT, Joung JG, Jung MH, Ko G, Wirapati P, Kim SH, Kim HC, Yun SH, Tan IBH, Ranjan B, Lee WY, Kim TY, Choi JK, Kim YJ, Prabhakar S, Tejpar S, Park WY. Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer. Nat Genet. 2020;52:594-603. [PubMed] [DOI] |
| 43. | Kim M, Min YK, Jang J, Park H, Lee S, Lee CH. Single-cell RNA sequencing reveals distinct cellular factors for response to immunotherapy targeting CD73 and PD-1 in colorectal cancer. J Immunother Cancer. 2021;9:e002503. [PubMed] [DOI] |
| 45. | Camilleri M. Diagnosis and Treatment of Irritable Bowel Syndrome: A Review. JAMA. 2021;325:865-877. [PubMed] [DOI] |
| 46. | Zhang L, Wang HL, Zhang YF, Mao XT, Wu TT, Huang ZH, Jiang WJ, Fan KQ, Liu DD, Yang B, Zhuang MH, Huang GM, Liang Y, Zhu SJ, Zhong JY, Xu GY, Li XM, Cao Q, Li YY, Jin J. Stress triggers irritable bowel syndrome with diarrhea through a spermidine-mediated decline in type I interferon. Cell Metab. 2025;37:87-103.e10. [PubMed] [DOI] |
| 51. | Chen W, Li T, Lin Y, Chen Z, OuYang M, Pei Y, Yi S, Huang S, Huang Z, Liao L, Zhou N, Lu J, Chen Z, Cao H, Tan B. Patchouli alcohol restores gut homeostasis in irritable bowel syndrome with diarrhea through myosin Va-mediated neurotransmitter regulation. Phytomedicine. 2025;141:156681. [PubMed] [DOI] |
| 52. | He S, Wang J, Huang Y, Kong F, Yang R, Zhan Y, Li Z, Ye C, Meng L, Ren Y, Zhou Y, Chen G, Shen Z, Sun S, Zheng S, Dong R. Intestinal fibrosis in aganglionic segment of Hirschsprung's disease revealed by single-cell RNA sequencing. Clin Transl Med. 2023;13:e1193. [PubMed] [DOI] |
| 53. | D'Apremont I, Marshall G, Musalem C, Mariani G, Musante G, Bancalari A, Fabres J, Mena P, Zegarra J, Tavosnanska J, Lacarrubba J, Solana C, Vaz Ferreira C, Herrera T, Villarroel L, Tapia JL; NEOCOSUR Neonatal Network. Trends in Perinatal Practices and Neonatal Outcomes of Very Low Birth Weight Infants during a 16-year Period at NEOCOSUR Centers. J Pediatr. 2020;225:44-50.e1. [PubMed] [DOI] |
| 54. | Egozi A, Olaloye O, Werner L, Silva T, McCourt B, Pierce RW, An X, Wang F, Chen K, Pober JS, Shouval D, Itzkovitz S, Konnikova L. Single-cell atlas of the human neonatal small intestine affected by necrotizing enterocolitis. PLoS Biol. 2023;21:e3002124. [PubMed] [DOI] |
| 55. | Olaloye OO, Liu P, Toothaker JM, McCourt BT, McCourt CC, Xiao J, Prochaska E, Shaffer S, Werner L; UPMC NICU Faculty; UPMC Pediatric Surgery Faculty, Gringauz J, Good M, Goldsmith JD, An X, Wang F, Snapper SB, Shouval D, Chen K, Tseng G, Konnikova L. CD16+CD163+ monocytes traffic to sites of inflammation during necrotizing enterocolitis in premature infants. J Exp Med. 2021;218:e20200344. [PubMed] [DOI] |