修回日期: 2024-04-06
接受日期: 2024-04-15
在线出版日期: 2024-05-28
慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者体内存在的大量亚病毒颗粒可以诱导免疫耐受, 导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的持续感染. 患者要实现功能性治愈的目标, 则需要获得血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)的消失, 但目前临床上尚缺乏有效抑制HBV共价闭合环状DNA的有效药物, 因此HBsAg很难被清除. 蛋白质的泛素化修饰是HBsAg降解的一条潜在路径, 这将有可能改变HBV的生存和免疫环境. 本文重点对有关HBsAg的泛素化, 包括类泛素化和去泛素化的研究进行综述, 以期为CHB抗病毒治疗探索新的途径提供参考.
核心提要: 慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染的主要原因之一是由于患者体内存在大量血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg), 导致患者特异性免疫功能下降, 病毒难以被清除. HBsAg的泛素化修饰和降解, 有可能改变患者体内HBV的生存和免疫环境, 因此, 加强该领域的研究, 有可能开发出新的药物, 以增加实现功能性治愈的机会.
引文著录: 牛安行, 刘锦, 朱传武. 乙型肝炎表面抗原泛素化修饰的研究进展. 世界华人消化杂志 2024; 32(5): 333-338
Revised: April 6, 2024
Accepted: April 15, 2024
Published online: May 28, 2024
The large number of subviral particles existing in chronic hepatitis B (CHB) patients can induce immune tolerance, leading to persistent infection with hepatitis B virus (HBV). In order to achieve the goal of functional cure, patients need to obtain the disappearance of serum hepatitis B surface antigen (HBsAg). However, currently there is still a lack of effective drugs to inhibit HBV covalently closed circular DNA, and thus HBsAg is difficult to be removed. Ubiquitination modification of proteins is a potential path for HBsAg degra-dation, which would have the potential to alter the HBV survival and immune environment. This review focuses on the ubiquitination of HBsAg, including neddylation and deubiquitination, in order to explore new approaches of antiviral therapy in CHB.
- Citation: Niu AX, Liu J, Zhu CW. Progress in research of ubiquitination modification of hepatitis B surface antigen. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2024; 32(5): 333-338
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v32/i5/333.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v32.i5.333
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)可致人类形成急、慢性病毒感染. 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)反复发作, 则可进展为肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC). 据世界卫生组织估计, 全球约有2.96亿慢性HBV感染者, 每年新增感染人数约150万人, 2019年大约有82万人死亡[1]. 目前我国普通人群血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)流行率约为6.1%, HBV慢性感染者约8600万人[2]. 因此, HBV感染仍然是威胁人类健康的严重公共卫生问题.
目前治疗乙型肝炎的抗病毒药物主要包括两类, 即核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]和聚乙二醇干扰素-α(pegylated interferon, PegIFN-α). 根据HBV相关生物标志物的变化, 抗病毒治疗的转归可分为部分治愈、功能性治愈(临床治愈)和完全治愈[3]. 由于肝细胞核内共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)和整合的HBV DNA难以被清除, 因此目前乙型肝炎还不能获得完全治愈, 但功能性治愈对部分合适的患者是有可能实现的. 所谓功能性治愈是在抗病毒治疗后, 在HBV DNA和乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)消失的基础上, 获得HBsAg血清学清除, 伴或不伴随乙型肝炎表面抗体(hepatitis B surface antibody, 抗-HBs)的产生. HBsAg的清除可源自PegIFN-α或NAs的抗病毒治疗, 也可发生于HBsAg的自发清除[4].
蛋白质泛素化是一种常见的蛋白修饰类型, 几乎参与了所有的生命过程. 据报道, 细胞内大约80%-90%的蛋白质均通过泛素化修饰而降解. 泛素介导的蛋白质修饰通过对其稳定性、定位、活性以及相互作用的调控, 在细胞生命周期各个方面广泛参与了诸如细胞周期、转录调节、细胞凋亡、DNA损伤修复、囊泡运输等生理过程[5]. 同时, 蛋白质泛素化修饰在疾病发生发展和治疗中的作用也越来越受到关注. 鉴于HBsAg降解对乙型肝炎功能性治愈具有的重要意义, 因此本文对HBsAg泛素化修饰的研究进行综述, 以期进一步了解两者之间的关系.
对于HBV复制及其相关肝病的泛素化研究目前尚不充分. 近年的研究表明, 宿主泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)在HBV复制及其发病机制中具有重要作用. 作为一种翻译后修饰, UPS的主要功能是介导细胞蛋白质的降解. UPS由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素激活酶(ub-activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ub-conjugating enzyme, E2)、泛素连接酶(ub-ligating enzyme, E3)和蛋白酶体组成. 通常, 激活的泛素在E3连接酶的作用下, 特异性地与蛋白质底物结合, 随后通过蛋白酶体降解底物蛋白.
多项研究表明, 宿主可利用UPS作为防御机制以促进HBV的清除, 主要是通过UPS选择性降解病毒蛋白并抑制病毒复制以达到抗病毒的作用. 已报道有不同的HBV蛋白被UPS降解. 例如, Np95/ICBP90样环指蛋白(Np95/ICBP90-like RING finger protein, NIRF)是一种E3泛素连接酶, 其与乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen, HBcAg)结合, 可致UPS介导的HBcAg降解[6]. 细胞凋亡蛋白2(apoptosis protein 2, cIAP2)具有E3连接酶活性, 能够促进UPS介导的乙肝病毒聚合酶(HBV polymerase, HBV Pol)蛋白的降解[7]. 磷脂加扰酶1可通过泛素化和蛋白酶体依赖性途径促进乙型肝炎X抗原(hepatitis B X antigen, HBxAg)的降解以抑制病毒复制[8]. 此外, 具有E3连接酶功能的多种三联基序(tripartite motif, TRIM)蛋白, 包括TRIM5、TRIM6、TRIM11、TRIM14等, 已被证明可以抑制HBV的转录[9,10].
同时, HBV也可以利用UPS以维持和促进病毒复制. 以HBxAg为例, Liu等研究显示[11], E3连接酶HDM2通过阻断泛素化介导的降解, 促进HBxAg的类泛素化修饰以增强HBxAg的稳定性; 细胞FLICE抑制蛋白可以与HBxAg相互作用, 保护其免受泛素依赖性降解以维持HBxAg的稳定性[10]; 泛素特异性蛋白酶15直接与HBxAg相互作用, 可减少病毒蛋白的泛素化, 避免被蛋白酶体降解[12]. 另外, HBxAg可以通过增加E3连接酶MSL2的表达来激活和增强HBV cccDNA的稳定性[13]. HBxAg可以与DNA损伤结合蛋白1(DNA damage-binding protein 1, DDB1)和Cullin4(CUL4)相互作用, 形成HBx-DDB1-CUL4 E3连接酶复合物, 基于与DDB1和CUL4的相互作用, HBxAg可以刺激病毒转录[14]. 并且, HBxAg可以在基因水平上降低具有E3连接酶功能的TRIM22的表达, 从而促进病毒基因的转录[15].
HBV基因组由3.2kb部分互补的松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)构成, 包含四个开放读码框. HBV通过钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白进入宿主细胞. 无包膜的病毒基因组转运到肝细胞核后, 宿主细胞通过DNA修复途径将rcDNA转化为cccDNA, 从而形成了所有HBV mRNA的转录模板[16]. 在肝细胞质中, 转录的HBV mRNA可翻译多种病毒蛋白, 包括小/中/大表面抗原(small/middle/large surface antigen, S-HBsAg/M-HBsAg/L-HBsAg)、HBeAg、HBcAg、HBV Pol蛋白和HBxAg[17].
HBsAg可由cccDNA或整合到肝细胞核中HBV S基因转录、翻译而来. cccDNA作为转录模板产生感染性HBV颗粒和非感染性亚病毒颗粒(subviral particles, SVPs), 并将它们释放到血液中[18]; 整合的HBV DNA只能表达S-HBsAg和M-HBsAg. HBV小包膜蛋白(S-HBsAg)能够在真核细胞中指导小球型SVPs的形成. SVPs的形成发生于内质网-高尔基体中间体(ER-Golgi intermediate compartment, ERGIC), 是HBV在肝细胞内产生的主要病毒产物, 其水平是患者血液中病毒颗粒的10000-100000倍. 高水平的SVPs, 或者HBsAg可以诱导免疫耐受, 有利于病毒长期感染. Yang等[19]研究表明, HBV表面蛋白在肝细胞内是通过20S蛋白酶体依赖性途径降解, 而非泛素依赖的26S蛋白酶体途径降解. 推测其原因可能是SVPs在ERGIC中出芽失败, 而不是S蛋白在内质网中发生错误折叠或者聚集引起.
目前对于HBsAg泛素化修饰的研究很有限. 泛素化修饰可能是HBsAg降解的一条途径, 因此, 这对临床实现CHB的功能性治愈具有潜在的意义, 这方面的研究也已经受到重视.
β-转导素重复序列蛋白(β-transducin repeat-containing protein, β-TrCP)是一种E3泛素连接酶. Tu等[20]研究表明, β-TrCP诱导HBsAg的K48位多聚泛素化链形成, 促进HBsAg通过蛋白酶体途径降解, 并下调细胞内和细胞外的HBsAg水平. β-TrCP对Myc-HBsAg的下调具有特异性, 与Myc-HBcAg和 Myc-HBxAg质粒共转染后并不影响其蛋白的表达. 并且, β-TrCP对Myc-HBsAg的调节并非发生在HBV mRNA水平. 同样, β-TrCP可以显著抑制pHBV-1.3质粒在HepG2细胞内和细胞外的 HBsAg水平. 将β-TrCP、Myc-HBsAg和HA-Ub质粒在HepG2细胞内共转染后, 发现β-TrCP与Myc-HBsAg存在相互作用, β-TrCP下调Myc-HBsAg并促进Myc-HBsAg的泛素化. 进一步研究的结果显示, β-TrCP显着增强了野生型HBsAg而非突变体HBsAg的泛素化. 该研究证实, β-TrCP是HBsAg的E3泛素连接酶. 因此, 利用HBsAg的泛素化降解途径, 有可能降低CHB患者体内的HBsAg水平, 从而改变患者体内HBV的生存和免疫环境, 这对实现CHB患者的功能性治愈具有潜在的价值.
如前所述, NIRF作为一种新的E3泛素连接酶, 可与HBcAg相互作用并促进其泛素化降解. 在HepG2细胞中转染pAAV-HBV1.3, 发现NIRF抑制了HBV DNA的复制和HBsAg、HBeAg的分泌. 在表达HBV的小鼠模型中, 也有类似的发现[6]. 因此, NIRF具有抑制HBV复制及其蛋白表达的作用.
TRIM蛋白家族成员包含一个环指结构域, 因此该家族中的大多数均为E3泛素连接酶. TRIM蛋白的特征在于其存在三个锌结合域, 一个环, 一个B盒类型1和类型2, 以及一个卷曲螺旋区域[21]. TRIM32作为E3泛素连接酶, 通过其保守结构域中的环指, 参与蛋白质的泛素化, 降解蛋白质并调节其活性. 在HCC的研究中, Cui等[21]发现TRIM32在HCC患者肿瘤组织和HCC细胞系中均明显上调, 其表达模式与HCC患者的组织学分级、肿瘤大小和HBsAg的表达呈正相关关系. Song等[22]发现TRIM25与HBxAg存在相互作用, 并通过K90位泛素化促进其蛋白酶体的降解, 并且TRIM25可以显著抑制pgRNA、HBsAg和HBeAg的表达. 此外, Fan等[23]发现中草药黄芩苷通过诱导HepG2细胞表达和稳定E3泛素连接酶TRIM25来抑制乙肝病毒的复制. 在TRIM25基因敲除细胞中, HBV DNA、pgRNA和HBsAg水平显著高于未敲除细胞. 并且在TRIM25被敲除后, 黄芩苷失去了对HBV的复制抑制作用.
编码泛素化的HBcAg慢病毒载体(lentiviral vectors encoding ubiquitinated hepatitis B core antigen, LV-Ub-HBcAg)能够有效地转导入树突状细胞(dendritic cells, DCs), 诱导T细胞向Th1极化, 产生HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL). 在HBV转基因小鼠中, LV-Ub-HBcAg诱导出强大的细胞免疫反应, 可以打破免疫耐受, 并诱导有效的抗病毒免疫应答[24]. Dai等[25]将LV-Ub-HBcAg转导入DCs, 再免疫HBV转基因小鼠, 发现Th1/Th2细胞因子比值显著增加, 血清HBsAg水平和肝组织中HBsAg表达均显著减少. 另外, 在HBV转基因小鼠研究中, 发现泛素-HBcAg-细胞质转导肽融合蛋白不仅显著增加了白细胞介素-2和干扰素-γ的水平, 也诱导了更多的IFN-γ+CD8+T细胞和HBV特异性CTL反应, 由此引起血清中HBsAg水平降低, 肝组织中HBsAg和HBcAg表达下降[25]. 提示这种融合蛋白对慢性和持续性HBV感染具有潜在的主动免疫治疗价值.
Yuan等[26]应用在细胞培养中氨基酸稳定同位素标记技术, 对整合有HBV的HepG2.2.15细胞系和HepG2细胞系的宿主泛素组和蛋白质组学进行研究, 发现宿主细胞为了应对HBV的存在, 在总共鉴定的7188个蛋白质中, 有近19%的蛋白质水平发生2倍以上的变化. 进一步分析证实, 在1476个发生泛素化改变的宿主蛋白中, 鉴定出3798个泛素化赖氨酸位点. 整体蛋白质组与泛素组呈负相关, 提示泛素化可能参与了HBV整合后宿主蛋白的降解. 为了确定应对HBV整合而发生泛素化变化的相关蛋白质的代谢途径, 研究者进行了KEGG数据库分析, 发现VAMP3、VAMP8、DNAJB6、RAB8A、LYN、VDAC2、OTULIN、SLC1A4、SLC1A5、HGS和TOLLIP发生泛素化改变. 对其中的DNAJB6进行研究, 证实DNAJB6蛋白发生了泛素化, 并且其过表达可显著减少HBsAg和HBeAg的分泌. 在此研究中, 还发现了5种新的宿主因子SLC1A4、SLC1A5、EIF4A1、TOLLIP和BRCC36, 它们均显著减少了HBsAg和HBeAg的分泌.
Kao等[27]开发了一个新的核酸聚合物(nucleic acid polymers, NAPs), 称为S抗原转运抑制寡核苷酸聚合物(S-antigen transport-inhibiting oligonucleotide polymers, STOPS). STOPS分子ALG-10000能显著减少HBV产生的细胞外HBsAg. ALG-10000由20个重复的腺苷和5-甲基胞嘧啶锁定核酸(locked nucleic acid, LNA)核苷组成, 由硫代键连接. STOPS的疗效比传统NAPs有显著的提高, 在体外比NAPs至少强20倍, 可以显著降低患者血清中HBsAg水平[28,29]. Kao等[27]研究显示, 在表达NTCP的HBV感染的HepG2细胞中, ALG-10000以浓度依赖的方式减少HBV编码的细胞外HBsAg水平. 沉默针对宿主因子SRSF1、HNRNPA2B1、GRP78(HspA5)、RPLP1和RPLP2的RNA, 可以降低HBsAg的表达. 宿主蛋白RPLP1/RPLP2和GRP78在HBsAg的翻译、蛋白折叠和降解中发挥作用. ALG-10000和敲低RPLP1/2和GRP78能降低HBsAg水平, 主要是促进了HBsAg的泛素化和在蛋白酶体中的降解. 在HepG2.2.15细胞中, 用ALG-10000处理后, HBsAg的泛素化水平几乎是模拟对照样本的2倍, 沉默RPLP2后也得出类似的结果. 说明STOPS抑制HBsAg的产生并加速其降解, 可能有助于CHB的功能性治愈.
与泛素化类似, 蛋白质类泛素化, 或者称为蛋白质拟素化(Neddylation), 也是蛋白翻译后的一种修饰方式, 需要进行一个多步骤的反应, 通过类似于泛素化的E1-E2-E3酶促级联反应, 将类泛素小分子-神经前体细胞表达、发育下调8(neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 8, NEDD8)共价耦联到底物蛋白上, 调控底物蛋白的降解以维持机体正常生理功能. Cullin-RING E3泛素连接酶是最大的泛素E3连接酶家族, 介导细胞内约20%蛋白质的泛素化修饰. 类泛素化依赖于NEDD8, 它是一种包含81个氨基酸的泛素样多肽, 与特定的赖氨酸残基或底物的N端结合. 抑制Cullin-RING泛素连接酶的类泛素化, 可以阻碍蛋白质底物的降解[30-33]. NEDD8和Ube2m是类泛素化途径中的两个关键因子, 敲低NEDD8和Ube2m可导致HepaRG-HB2.7(X+)细胞内HBsAg水平显著下降[34], 说明类泛素化通路影响HBsAg的分泌.
MLN4924(pevonedistat)是类泛素化途径中一种有效的、选择性的NEDD8活化酶抑制剂. 在HepAD38细胞模型研究中, 证实MLN4924对HBV cccDNA和整合的HBV基因均具有作用, 既显著抑制了cccDNA的转录, 又抑制了HBV整合子编码的HBsAg, 细胞内的HBsAg的水平显著减少. 并且此过程不依赖于HBxAg, 在处理的42天期间HBV标记物获得持续抑制[34]. 为了进一步探讨类泛素化在HBV感染中的作用, Abounouh等[35]用siNEDD8和MLN4924处理HepG2.2.15.7细胞和HBV感染的hNTCP-30细胞. 结果显示, HBV感染增加了人肝细胞系中NEDD8的表达; 通过siRNA或MLN4924敲低NEDD8, HepG2.2.15.7和HepG2-hNTCP-30细胞中HBV的复制减少, 培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌受到显著抑制. 说明NEDD8可促进HBV的产生, 阻断类泛素化可以抑制病毒复制, 起到抗病毒作用. 因此, 对类泛素化途径进行干预可能是今后干扰HBV复制, 治疗CHB的一种新策略.
除了泛素化以外, 去泛素化也参与了HBV复制及其蛋白表达的调节. 蛋白质去泛素化是由一组去泛素酶(deubiquitinase, DUB)介导的、与泛素化调节相反的过程. 泛素特异性蛋白酶18(ubiquitin-specific protease 18, USP18)属于DUBs的USP亚家族, 介导靶蛋白的去泛素化. 干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15, ISG15)的表达受Ⅰ型干扰素诱导, 该基因编码的蛋白ISG15与泛素结构高度类似, 被鉴定为泛素样修饰体, 可以共价连接到靶蛋白上, 从而改变靶蛋白的各种生物学过程[36]. ISG15分别通过E1、E2和E3酶的作用共价修饰靶蛋白, 此过程称为ISG化(ISGylation). ISG15不仅是一种IFN-α/β诱导的泛素样修饰剂, 可以与细胞底物结合形成ISG化蛋白, 而且还通过稳定USP18, 成为Ⅰ型IFN信号的负调控因子[37]. USP18作为一种去泛素化酶, 特异性地将ISG15蛋白从其偶联蛋白中分离出来. 结构生物学研究表明, USP18对ISG15的特异性是由USP18序列内的ISG15结合盒1和盒2所介导. USP18通过特异性去除ISG15修饰, 并通过抑制Ⅰ型干扰素信号通路来抑制宿主的免疫应答. 既往研究发现, 在干扰素治疗无应答的CHB患者中, 有一系列的ISG蛋白发生上调, 其中两个重要的蛋白就是USP18和ISG15[38], 两者密切相关, 并且具有相同的信号通路, 即JAK/STAT通路.
在HepG2.2.15细胞中, 以及在转染了HBV1.3或HBV1.1表达质粒的HepG2细胞中, Li等[39]研究发现USP18的表达水平均高于HepG2细胞, 说明USP18在HBV复制过程中发挥重要作用. 在HepG2.2.15细胞研究中, 与对照组相比, 敲低USP18的表达可导致HBV前基因组RNA和总RNA水平显著下降, HBV DNA的合成、HBsAg和HBeAg的分泌显著减少, 说明沉默USP18可以有效抑制HBV的转录和表达. 将敲低的USP18质粒转染HepG2.2.15细胞, 经IFN-α处理后, 发现细胞内病毒蛋白HBcAg、HBsAg和HBeAg分泌被显著抑制. 进一步研究表明, USP18既具有ISG15依赖的功能, 又具有独立于ISG15的功能. 通过沉默USP18在HepG2.2.15细胞中的表达, 显著抑制了HBsAg等病毒蛋白的产生, 增加了ISGs的表达, 提示沉默USP18有助于抑制HBV的复制及其蛋白的表达. USP18的抑制激活了JAK/STAT信号通路, 磷酸化信号转导和转录激活因子1表达增加, 几种ISG的表达也增强, 说明USP18是影响HBV复制和蛋白产生的一个重要分子.
追求功能性治愈是目前CHB抗病毒治疗的热点, 对部分合适的患者也是可实现的目标, 其中HBsAg消失是CHB功能性治愈的必需要求. 由于缺乏有效作用于HBV cccDNA的强效药物, 因此, 如果有降低HBsAg水平的方法, 就有可能会改变 HBV生存的环境, 同时也会改变HBV感染者的免疫水平, 这将为CHB的治疗开辟新的途径. 目前有关HBsAg泛素化修饰的研究较少, 已开展的有关HBV复制及其蛋白表达的泛素化研究为本领域的探索提供了有益的参考. 同时, 针对HBV的去泛素化相关靶点也已经开展了一些探索, 并且具有潜在的研究前景. 因此, 我们相信, 加强针对HBsAg泛素化降解机制的研究, 将有可能开发出某些小分子化合物, 以促进HBsAg的泛素化, 减少HBV感染者体内过量的SVPs. 这将有利于CHB患者免疫功能的恢复, 并在现有的抗病毒药物治疗基础上, 增加患者实现功能性治愈的机会.
学科分类: 胃肠病学和肝病学
手稿来源地: 江苏省
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科学编辑:张砚梁 制作编辑:张砚梁
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