三七总皂甙对肝癌细胞株、甲胎蛋白异质体及高尔基体糖蛋白-73表达的影响

摘要

目的: 研究三七总皂甙(panax notoginsenosides, PNS)对不同肝癌细胞株、甲胎蛋白异质体(alpha-fetoprotein-L3, AFP-L3)分泌及高尔基体糖蛋白-73(Golgi glucoprotein 73, GP-73)的影响.

方法: 以肝癌细胞HepG2两种细胞株SMMC-7721和Bel-7402作为研究对象, 分为空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)组和不同浓度梯度(10-400 µg/mL)的PNS组, 共培养120 h, 利用MTT比色测定法检测细胞活性, ELISA及细胞分化法检测AFP-L3及GP-73活性.

结果: PNS在>200 µg/mL时可表现出对两种肝癌细胞株增殖的抑制, 高浓度PNS(400 µg/mL)对细胞活性影响较大, 抑制率与5-Fu(40 µg/mL)的作用相似. PNS组200、400 µg/mL剂量均明显抑制肝癌两种细胞株GP-73活性, 且剂量400 µg/mL的抑制作用与5-Fu组比较有显著差异(P<0.05). PNS组剂量达400 µg/mL时才能有效抑制肝癌两种细胞株AFP-L3活性, 与对照组比较差异显著(P<0.01); 且400 ng/mL剂量的抑制作用与5-Fu组没有显著差异.

结论: PNS具有抑制肝癌细胞株的生长, 降低AFP-L3与GP-73活性, 肝癌细胞基因分化, 诱导其在体外向正常肝细胞分化, 且效果与剂量-时间呈正相关.

关键词: 肝癌细胞株; 甲胎蛋白异质体; 高尔基体糖蛋白-73; 三七总皂甙

核心提示: 本研究发现, 三七总皂甙(panax notoginsenosides, PNS)能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖、诱导细胞凋亡或坏死, 并且随着药物浓度的增加而增强; 同时抑制甲胎蛋白异质体(lectin-reactive alpha-fetoprotein)、高尔基体糖蛋白-73(Golgi protein-73)的分泌, 通过作用于一系列的分子信号通路发挥抗肝癌细胞生长作用. 但就PNS对肝癌细胞株抑制和一系列作用的机制尚未完全明确, 需作进一步研究.

Influence of panax notoginsenosides on AFP-L3 and GP-73 expression in hepatoma cell lines

Xu-Dong Pei, Yu-Feng Zhai, Huai-Hong Zhang

Xu-Dong Pei, Yu-Feng Zhai, Huai-Hong Zhang, Department of Infectious Diseases, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473009, Henan Province, China

Correspondence to: Yu-Feng Zhai, Chief Physician, Department of Infectious Diseases, Nanyang Central Hospital, 312 Gongnong Road, Nanyang 473009, Henan Province, China. pxd_xiang@126.com

Received: May 31, 2014
Revised: June 20, 2014
Accepted: July 5, 2014
Published online: August 28, 2014

Abstract

AIM: To study the effect of panax notoginsenosides (PNS) on the expression of alpha-fetoprotein-L3 (AFP-L3) and Golgi glucoprotein 73 (GP-73) in hepatoma cell lines.

METHODS: Hepatoma cell lines SMMC-7721 and Bel-7402 were used. The cells were divided into different groups and treated with 5-fluorouracil (5-Fu) or different concentrations of PNS (10-400 µg/mL) for 120 h. Untreated cells were used as controls. MTT assay was used to detect cell activity, and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect AFP-L3 and GP-73 levels.

RESULTS: PNS at concentrations > 200 µg/mL showed a significant inhibitory effect on hepatoma cell growth. PNS at a concentration of 400 µg/mL had comparable inhibitory effect to 5-Fu at 40 µg/mL. PNS at concentrations of both 200 and 400 µg/mL significantly inhibited GP-73 activity in hepatoma cells, and the inhibitory effect of PNS at 400 µg/mL was significantly higher than that of 5-Fu at 40 µg/mL (P < 0.05). PNS at 400 µg/mL could significantly suppress AFP-L3 in hepatoma cells compared with controls (P < 0.01), and the effect was similar to that of 5-Fu.

CONCLUSION: PNS can inhibit hepatoma cell proliferation and suppress AFP-L3 and GP-73 activity.

Key Words: Hepatoma cell line; Alpha-fetoprotein-L3; Golgi glucoprotein 73; Panax notoginsenosides

0 引言

三七总皂甙(panax notoginsenosides, PNS)是从五加科人参属草本植物三七中提取的有效成分, 是多系统靶向药物, PNS不但具有良好的止血、活血化瘀双向药理作用, 还具有明显促进肝细胞增殖再生, 减轻肝细胞炎症, 抑制肝细胞纤维化. 近年研究表明[1]PNS能够调控人体肝脏卵圆细胞代谢, 降低肝癌细胞活化基因的表达, 从而能够有效抑制肝癌细胞的生长[2]. 还有学者用小鼠移植性肿瘤模型对肝癌实体型HepG2进行了研究, 认为PNS对HepG2有良好的抗癌作用[3]. 本研究选择两种人肝癌细胞株(SMMC-7721, Bel-7402), 观察PNS对体外培养肝癌细胞株生长、甲胎蛋白异质体(lectin-reactive alpha-fetoprotein, AFP-L3)及高尔基体糖蛋白-73(Golgi protein 73, GP-73)分泌的影响. 现报道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌SMMC-7721细胞株和人肝癌Bel-7402细胞株细胞来源于新乡医学院免疫学教研室. 三七总苷注射液(250 mg/支, 昆明制药集团股份有限公司, 纯度为95%). 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)注射液(250 g/10 mL, 上海旭东海普药业有限公司). 细胞培养基含10%FBS的DMEM培养基由Gibco公司提供. GP-73蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供. 噻唑蓝(margaret blue, MTT Sigma公司). AFP-L3检测Roche全自动化学发光定量分析, 使用同型配套试剂; 96孔培养板(Corning公司); BH-2型酶标仪(美国Bio-rad公司). 免疫组织化学试剂主要包括: GP-73免疫组织化学染色法试剂盒(深圳联科公司); DAB显色剂(福州迈新生物技术开发有限公司); FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪(美国BD公司); 酶联免疫检测仪(型酶联免疫仪(美国Sigma公司); 751分光光度计(上海分析仪器厂).

1.2 方法

1.2.1 细胞株培养: 肝癌细胞HepG2细胞的两种细胞株BEL-7402、SMMC-7721用含有10%胎牛血清的DMEM培养基, 在37 ℃、5%CO₂浓度的孵箱中培养, 不表达乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg), 观察并记录微孔板中细胞生长情况, 并对细胞密度密度进行检测. 按照1:2的比例更换培养液, 提高细胞的存活率. 取对数生长期的细胞, 用胰酶消化洗脱, 进行细胞计数. 调整好细胞浓度后, 均匀地接种于96孔培养板, 每孔种植约10000个细胞, 每孔培养基体积100 µL, 取空白孔不接种细胞为系统空白孔, 置于37 ℃温度, 浓度为5%的CO₂空气中保存24 h, 使细胞展开贴壁.

1.2.2 细胞增殖抑制试验(MTT法): HepG2细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基和RPMI 1640培养基中, 37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养, 每3天换液传代1次. 将HepG2细胞调整为1.0×10⁴/mL接种到96孔细胞培养板中, 每孔0.1 mL, 4 h后加入PNS, 终浓度分别为10、50、100、200、400 µg/mL, 并设阳性对照药5-Fu(40 µg/mL)组和溶媒对照组, 每个浓度均设6个复孔. 分别培养24、48、72、96、120 h后, 取出培养板, 每孔加入20 μL MTT(5 g/L)继续培养4 h, 经洗涤离心弃去上清, 并将其置入培养液中, 将血清与培养液搅拌均匀, 10 min后, 抽取上清液检测FP-L3和GP-73, 再利用MTT比色法[4]测量A₅₇₀值, 根据相关结算公式计算肝癌细胞增殖的抑制率, 实验重复6次. HepG2细胞的生长抑制率: 抑制率(%) = (1-A_PNS组/A_5-Fu组)×100%.

1.2.3 AFP-L3和GP-73含量的测定: AFP-L3浓度测定采用ELISA双抗体夹心法, AFP-L3浓度结果以ng/mL表示, >35 ng/mL作为临界值. GP-73测定采用双抗体夹心法(ADL Biotech Dev Co, USA)测定GP-73含量: 取GP-73抗体置于微孔板中, 制成固相载体. 取血清标准置入微孔板中, 促使GP-73抗体与血清中的GP-73充分结合, 清洗微孔板, 取生物素化GP-73抗体置入微孔板中, 待其充分结合后, 再使用清水冲洗微孔板. 滴入HRP亲和素, 洗净微孔板后, 滴入TMB待其变成蓝色后, 滴入稀硫酸, 使其终止反应, 终止反应后的颜色为黄色. 记录TMB颜色的深浅, 并利用酶标仪570 nm处检测其A值, 浓度为6.25 μg/mL并依次在最终值上递增1倍, 最后递增值为200 μg/mL. 建立坐标轴, 其中吸光度为纵向坐标, S1-S6浓度为横向坐标, 制作log-log双对数曲线. 根据曲线表达方式确定计算标准, 根据样品中的GP-73浓度与A值成正比, 计算标本GP-73浓度(μg/mL).

统计学处理 各组实验数据均重复3次以上. 计量资料用mean±SD表示, 各组间数据的比较, 多组间比较采用方差分析, 两样本均数的比较采用t检验, 数据统计采用SPSS17.0统计软件处理. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 PNS和5-Fu对不同体外人肝癌细胞生长的影响

MTT实验显示, 不同浓度PNS和5-Fu均能明显抑制SMMC-7721细胞增殖, 具有浓度依赖性, 随着浓度增加对两种人肝癌SMMC-7721和Bel-7402细胞抑制率得到增强. 其中低浓度PNS(10、50 μg/mL)对SMMC-7721和Bel-7402细胞活性影响较小, 高浓度PNS(400 μg/mL)对细胞活性影响较大, 抑制率与5-Fu(40 μg/mL)的作用相似(分别为67.5%、64.8%和60.4%、60.3%), 与对照组比较差异有统计学意义. 其中PNS(400 μg/mL)对Bel-7402细胞株的抑制作用亦与5-Fu组的作用相似, 较SMMC-7721细胞株的抑制率较高, 但无统计学差异(表1). PNS组对正常小鼠肝细胞无明显的影响, 而5-Fu组则抑制正常小鼠肝细胞的增殖.

表1 PNS体外对人肝癌HepG2 SMMC-7721和Bel-7402细胞生长的影响 (n = 3, mean±SD).

分组	药物剂量(μg/mL)	SMMC-7721		Bel-7402		肝癌HepG2
		A570	抑制率(%)	A570	抑制率(%)	A570
对照组	0	0.449±0.055	0	0.517±0.014	0	0.430±0.068
5-Fu	40	0.268±0.023	67.5	0.204±0.013	60.4	0.216±0.102
PNS	10	0.421±0.028a	36.6	0.408±0.027a	20.8	0.469±0.034
	50	0.409±0.011b	38.8	0.353±0.028b	31.5	0.475±0.048
	100	0.378±0.002b	40.3	0.231±0.031b	55.2	0.447±0.055
	200	0.289±0.016b	47.4	0.221±0.032b	57.1	0.452±0.218
	400	0.254±0.009	64.8	0.202±0.032	60.3	0.452±0.287

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组. 5-Fu: 5-氟尿嘧啶; PNS: 三七总皂甙.

2.2 不同浓度PNS各时间段对不同体外人肝癌细胞生长的影响

从图1可以看出: 6个浓度组处理HepG2细胞24-120 h, 绘制生长曲线, 对人肝癌SMMC-7721细胞株和Bel-7402细胞株的抑制, 随浓度增加抑制率递增, 均在400 μg/mL时达到最大抑制率, 同时随着作用时间的增加而增强. 但对正常的细胞增殖和抑制均不明显, 在第120 h后SMMC-7721细胞株的抑制率和Bel-7402细胞株的抑制率与HepG2的比较均有显著差异(均P<0.01), 且对SMMC-7721细胞株的抑制率优于对Bel-7402细胞株的抑制率, 并随时间延长而增强.

图1 不同浓度PNS对人肝癌各细胞株的抑制率. A: 不同浓度PNS对人肝癌HepG2的抑制率; B: 不同浓度PNS对人肝癌SMMC-7721细胞株的抑制率; C: 不同浓度PNS对人肝癌Bel-7402细胞株的抑制率. PNS: 三七总皂甙.

2.3 PNS对人肝癌HepG2细胞AFP-L3和GP-73含量的影响

结果表明, PNS组对SMMC-7721细胞株和Bel-7402细胞株的抑制呈剂量依赖性, 200、400 μg/mL剂量均明显抑制肝癌两种细胞株GP-73活性, 且剂量400 μg/mL的抑制作用与5-Fu组比较差异有统计学意义(P<0.05); 同时对SMMC-7721细胞株GP-73活性抑制率好于Bel-7402细胞株(P<0.05). PNS剂量400 μg/mL时才能有效抑制肝癌两种细胞株AFP-L3活性; 且400 μg/mL剂量的抑制作用与5-Fu组差异无统计学意义, 同时对SMMC-7721细胞株AFP-L3活性抑制率与Bel-7402细胞株相比较, 差异无统计学意义(表2).

表2 PNS 对人肝癌HepG2细胞GP-73含量和AFP-L3含量的影响 (mean±SD, n = 2, g/mL).

分组	药物剂量(μg/mL)	GP-73		AFP-L3
		SMMC-7721	Bel-7402	SMMC-7721	Bel-7402
对照组	0	95.81±59.60	96.80±61.30	42.09±8.17	51.62±7.99
5-Fu	20	52.23±56.84	51.46±36.25	22.32±5.54	23.65±6.01
PNS	10	96.02±55.33	95.30±52.33	42.33±7.86	44.52±5.69
	50	90.54±49.32	92.37±48.68	40.52±8.02	40.36±6.53
	100	88.31±47.03	86.53±54.88	35.98±7.82	36.53±7.21
	200	60.03±39.88a	64.28±38.53a	30.53±6.59a	31.55±6.24a
	400	34.03±25.44bc	40.55±24.62bc	20.71±8.67b	22.33±5.91b

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组;

^cP<0.05 vs 5-Fu. 5-Fu: 5-氟尿嘧啶; PNS: 三七总皂甙; AFP-L3: 甲胎蛋白异质体; GP-73: 高尔基体糖蛋白-73.

3 讨论

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的早期诊断仍是目前肝癌诊治研究的热点之一. 传统上AFP是诊断HCC的主要方式之一, 虽然在疾病的临床诊断中具有一定的应用价值, 然而特异性和敏感性不强, 可能出现的漏诊的现象. 对此, 临床开始探求更加有效的诊断方式. 随着学者对HCC的深入研究, 发现GP-73和AFP-L3是能够清楚反应患者血清值的变化情况[5].

AFP-L3主要在肝癌细胞中的检出率相对较高, 他不仅会破坏肝细胞免疫功能结构, 还能增强肝癌细胞活性, 具有较高的敏感性, 能够应用于肝癌早期的诊断中[6]. AFP-L3阳性的肝癌细胞分离速度相对较快, 会造成患者病情呈严重化发展. 此外, AFP-L3阳性还可能造成肝癌细胞转移, 累及其他肾脏组织. AFP-L3阳性与AFP无明显关系, 但是与肿瘤直径呈正相关. 对此, 有学者认为AFP可能与肝癌的发生发展存在直接关系[7]. 有研究报道, PNS不仅能够降低肿瘤细胞活性, 其中人参皂苷Rb1也可达到抗肝癌的目的. Yamamoto等[8]学者观察GP-1对小鼠肝癌的治疗效果, 利用GP-1灌胃给药治疗, 了解该药物对Heps的抑制作用, 研究结果显示, 对Heps的抑制率可高达62%[9]. 本文结果表明, 不仅能够降低人肝癌细胞株的活性, 还能够减少SMMC-7721对细胞的分泌量, 能够有效控制疾病的发展. 临床研究表明, 取浓度≥200 μg/mL的PNS用于肝癌的治疗中时, 发现该药物能够有效HepG2、BEL-7402等增殖、转移等, 且持续取高浓度PNS治疗, 对肝癌细胞的抑制作用越强.

Ohashi等[10]发现机体正常情况下, GP-73是高尔基体顺面膜囊上的一种整合膜蛋白, 是一种与病毒性肝炎感染及肝细胞恶性转化密切相关的糖蛋白, 肝细胞癌变呈过表达状态, 在肝癌组织及外周血中明显增高, 其可以作为肝癌标志物, GP-73阳性细胞灶可以被认为是肝细胞癌癌前病变[11]. 三七的主要活性成分是人参皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rh2以及三七皂苷R1等. 毛一雷等[12]也发现GP-73在肝癌患者中的水平最高, 肝癌患者中的敏感性达到76.9%, 特异性达到92.8%; 而AFP的敏感性仅为48.6%. 人参皂苷Rb1具有抑制肿瘤增殖、增加化疗药物的敏感性、逆转肿瘤细胞耐药等作用. 人参皂苷Rg1可通过调节癌基因和抑癌基因表达而抑制骨肉瘤细胞的增殖[13], 本研究发现PNS可明显降低SMMC-7721细胞恶性程度指标AFP-L3浓度和GP-73活力, 且在一定范围内呈显著量效关系, 通过阻断癌细胞基因分化, 使基因表达的表型向正常方向逆. 本实验还发现PNS组对SMMC-7721细胞株GP-73和AFP-L3活性抑制率要优于度Bel-7402细胞株的抑制, 对SMMC-7721细胞株GP-73活性抑制率优于5-Fu组. 文玲玲等[14]发现人参皂苷能够通过降低SMMC-7721细胞活性, 减少其对机体细胞结构的破坏, 还能够降低淋巴细胞、SMMC-7721等的黏附作用, 不仅能够提高手术治疗效果, 降低病情复发率, 还能够有效抑制肝癌细胞的转移, 避免累积其他肾脏组织等, 本实验研究结果与其相符. 针对上述研究成果, 本文认为, 可加大对PNS的研发, 达到提高肝癌患者预后生存质量的目的.

目前, 尽管活血化瘀药被大量运用于肿瘤防治, 但该类药物的双向调节机制在临床上尚有争议的问题, 但本研究发现, PNS能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖、诱导细胞凋亡或坏死, 并且随着药物浓度的增加而增强; 同时抑制AFP-L3、GP-73的分泌[15], 通过作用于一系列的分子信号通路发挥抗肝癌细胞生长作用. 但就PNS对肝癌细胞株抑制和一系列作用的机制尚未完全明确, 需作进一步研究.

评论

背景资料

三七总皂甙(panax notoginsenosides, PNS)是从五加科人参属草本植物三七中提取的有效成分, 是多系统靶向药物, PNS不但具有良好的止血、活血化瘀双向药理作用, 还具有明显促进肝细胞增殖再生, 减轻肝细胞炎症, 抑制肝细胞纤维化. 近年研究表明, PNS能够调控人体肝脏卵圆细胞代谢, 降低肝癌细胞活化基因的表达, 从而能够有效抑制肝癌细胞的生长. 还有学者用小鼠移植性肿瘤模型对肝癌实体型HepG2进行了研究, 认为PNS对HepG2有良好的抗癌作用.

同行评议者

何向辉, 教授, 天津医科大学总医院普通外科

研发前沿

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的早期诊断仍是目前肝癌诊治研究的热点之一. 传统上甲胎蛋白异质体(alpha-fetoprotein-L3, AFP-L3)是诊断原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要方式之一, 虽然在疾病的临床诊断中具有一定的应用价值, 然而特异性和敏感性不强, 可能出现的漏诊的现象.

相关报道

Ohashi等发现机体正常情况下, 高尔基体糖蛋白-73(Golgi glucoprotein 73, GP-73)是高尔基体顺面膜囊上的一种整合膜蛋白, 是一种与病毒性肝炎感染及肝细胞恶性转化密切相关的糖蛋白, 肝细胞癌变呈过表达状态, 在肝癌组织及外周血中明显增高, 其可以作为肝癌标志物, GP-73阳性细胞灶可以被认为是肝细胞癌癌前病变.

同行评价

本研究选题科学, 结果可信, 结论客观, 具有一定的学术价值.

备注

编辑: 田滢 电编:闫晋利

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