TPRV1、TPRV2在腹泻型肠易激综合征大鼠中的表达及其与内脏敏感性的关系

doi:10.11569/wcjd.v21.i36.4133

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本文章的期刊信息

出版物名称

世界华人消化杂志

ISSN

1009-3079

本文章的出版商

Baishideng Publishing Group Inc, 7041 Koll Center Parkway, Suite 160, Pleasanton, CA 94566, USA

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研究快报 Open Access

世界华人消化杂志. 2013-12-28; 21(36): 4133-4139
在线出版日期: 2013-12-28. doi: 10.11569/wcjd.v21.i36.4133

TPRV1、TPRV2在腹泻型肠易激综合征大鼠中的表达及其与内脏敏感性的关系

黄适, 张涛, 陈远能, 黄斌, 王坚

黄适, 湖南中医药大学湖南省长沙市 410007

张涛, 陈远能, 黄斌, 广西中医药大学附属瑞康医院广西壮族自治区南宁市 530011

王坚, 重庆医科大学药学院重庆市 400016

黄适, 副主任医师, 硕士生导师, 主要从事肠易激综合征中西医结合防治的研究.

基金项目: 广西自然基金资助项目, No. 2012GXNSFAA053099; 广西科学研究与技术开发计划基金资助项目, No. 桂科攻1298003-7-2.

作者贡献分布: 黄适负责课题设计; 数据处理、论文撰写由黄适与张涛共同完成; 研究过程由陈远能、黄斌及王坚完成.

通讯作者: 张涛, 副主任医师, 530011, 广西壮族自治区南宁市华东路10号, 广西中医药大学附属瑞康医院. 453636438@qq.com

收稿日期: 2013-09-18
修回日期: 2013-10-28
接受日期: 2013-11-06
在线出版日期: 2013-12-28

摘要

目的: 检测肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)大鼠下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2表达, 探讨其与内脏敏感性的关系.

方法: 40只SPF级♂SD大鼠按体质量随机分为两组, 每组20只. 除正常组外, 其余大鼠均采用番泻叶灌胃+束缚应激刺激4 wk法制备模型, 第4周末处死全部大鼠, 截取下丘脑、垂体、结肠. 应用HE染色、甲苯胺蓝染色分别检测结肠组织病理学及肥大细胞表达; 应用Real-time PCR、Western blot技术分别检测下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2表达; 应用腹部回缩反射结合腹壁紧张度综合评估大鼠内脏敏感性.

结果: 模型组大鼠存在内脏敏感性增高和肥大细胞大量活化的特点, 其下丘脑-垂体-结肠TPRV1和TPRV2 mRNA及其蛋白呈高表达变化; 与正常组比较, 有统计学意义(P<0.05).

结论: TPRV1和TPRV2高表达与肠易激综合征大鼠内脏敏感性增高呈正相应关系.

关键词: 辣素受体-1; 辣素受体-2; 内脏敏感性; 肠易激综合征

核心提示: 肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)究其发病的重要病理机制是内脏敏感性增高, 其中脑肠互动在IBS发病中占据关键地位. TPRV1、TPRV2作为重要的神经递质参与内脏疼痛信号转导的作用不容忽视, TPR通道在内脏痛觉感受和增敏机制占据重要地位, 以TPRV1、TPRV2拮抗为靶点开展药物研究, 将有望为IBS防治提供新的思路.

引文著录: 黄适, 张涛, 陈远能, 黄斌, 王坚. TPRV1、TPRV2在腹泻型肠易激综合征大鼠中的表达及其与内脏敏感性的关系. 世界华人消化杂志 2013; 21(36): 4133-4139

Relationship between expression of TPRV1 and TPRV2 and visceral hypersensitivity in rats with irritable bowel syndrome

Shi Huang, Tao Zhang, Yuan-Neng Chen, Bin Huang, Jian Wang

Shi Huang, Hunan University of TCM, Changsha 410007, Hunan Province, China

Tao Zhang, Yuan-Neng Chen, Bin Huang, the Affiliated Ruikang Hospital of Guangxi University of TCM, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Jian Wang, Chongqing University of Medicine, Chongqing 400016, China

Supported by: the Guangxi Natural Science Foundation. No. 2012GXNSFAA053099; and the Guangxi Science and Technology Development Program. No. 1298003-7-2.

Correspondence to: Tao Zhang, Associate Chief Physician, the Affiliated Ruikang Hospital of Guangxi University of TCM, 10 Huadong Road, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. 453636438@qq.com

Received: September 18, 2013
Revised: October 28, 2013
Accepted: November 6, 2013
Published online: December 28, 2013

Abstract

AIM: To analyze the pathogenesis of irritable bowel syndrome (IBS) by observing the expression of TPRV1 and TPRV2 in the hypothalamus-pituitary-colon and visceral hypersensitivity in rats.

METHODS: Forty rats were divided into two groups randomly: a normal group and an IBS group. Diarrhea-predominate IBS was induced by intragastrical administration of folium sennae and bondage stress. At the end of the fourth week, all rats were sacrificed by intraperitoneal anesthesia. Histopathological changes were detected by HE staining. The expression of mast cells was detected by toluidine blue staining. The protein and mRNA expression of VR1 and VR2 was assayed by Western blot and real-time PCR. Visceral hypersensitivity was evaluated by colorectal distension and abdominal wall tension.

RESULTS: IBS was characterized by visceral hypersensitivity and mast cell activation. The expression of VR1 and VR2 in the hypothalamus-pituitary-colon was significantly increased in the IBS group compared with the normal group (all P < 0.05).

CONCLUSION: High expression of VR1 and VR2 may mediate visceral hypersensitivity and plays an important role in the development of IBS.

Key Words: Transient receptor potential vanilloid-1; Transient receptor potential vanilloid-2; Visceral hypersensitivity; Irritable bowel syndrome

Citation: Huang S, Zhang T, Chen YN, Huang B, Wang J. Relationship between expression of TPRV1 and TPRV2 and visceral hypersensitivity in rats with irritable bowel syndrome. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2013; 21(36): 4133-4139
URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v21/i36/4133.htm
DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v21.i36.4133

0 引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是指一组包括持续或间歇发作的腹痛、腹胀、排便习惯和大便形状异常而又缺乏生化学和形态学可资解释的症候群[1]. 几十年来人们不断提出各种各样的假说试图阐明IBS的发病机制及病理生理, 但几乎没有一种单一的发病机制能解释所有IBS的临床表现[2,3]. 随着对IBS动力、感觉、炎症、免疫、激素、心理、等方面的研究不断深入, 内脏感觉敏感性增高引发IBS为消化专家所共识, 从辣素诱导辣素受体敏化→电压门控通道改变→Ca²⁺内流→内脏敏感性异常的模型中, 可知内脏敏感性异常在IBS的发病地位不容忽视[4]. 神经、免疫、内分泌系统的多种细胞及活性物质可能参与IBS患者内脏敏感性异常的调节, 内脏感觉异常是IBS的病理基础[5]. 本研究从下丘脑-垂体-结肠轴TPRV1、TPRV2蛋白及其mRNA表达, 探讨其与内脏敏感性关系.

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级♂SD大鼠40只, 体质量200 g±20 g, 由广西中医药大学动物实验中心提供[许可证号: SCXK(桂) 2005-0021]. 全部大鼠适应性喂养1 wk后进行实验研究. 40 g/L甲酫、无水乙醇、二甲苯、Harris苏木精液、伊红染色液、APES、1%盐酸乙醇等. 手术器械、研钵、直灌胃针、金属夹、石蜡油、一次性注射器(1、5、10 mL); 0.5及1.5 mL Eppendorf管购自美国AEGEN公司. TP1020自动脱水机、RM2135徕卡切片机、HI1210徕卡摊片机、HI1220徕卡烘片机、EG1160徕卡自动包埋机等. 甲苯胺蓝及无水乙醇购自上海国药集团, TPRV1、TPRV2一抗购自Santa公司、二抗、DAB显色液均购自武汉博士德生物科技公司, 实时荧光定量PCR、Western blot委托广州吉坤生物技术有限公司完成. 番泻叶生药: 购自本院药方. 生产单位为: 广东康美中药饮片厂. 将番泻叶置60 ℃烘箱中密封水浸泡12 h, 纱布过滤、浓缩为1g生药/100 mL药液. 浓缩的条件为60 ℃冷风吹液面. 4 ℃储存备用.

1.2 方法

1.2.1 IBS模型制备: ♂SD大鼠40只, 适应性喂养1 wk后称体质量, 随机分为正常组、模型组, 每组20只. 同步饲养, 等剂量生理盐水灌胃4 wk, 模型组大鼠予4 ℃的10 g/kg番泻叶液每日1次/d, 连续4 wk, 第3周开始模型组灌胃后用宽胶纸束缚两前肢1 h, 1次/d. 持续到第4周. 第4周末处死全部大鼠, 取下丘脑、垂体、全部结肠, 分两部分, 分别置于10%中性甲醛中固定及放入液氮中冷冻备测.

1.2.2 指标检测: (1)结肠组织病理学检测: 常规石蜡包埋, 4 μm切片, HE染色, 光镜下分析肠道病理变化; (2)甲苯胺蓝染色检测结肠MC表达: 50 ℃烘片2 h后, 石蜡切片常规脱蜡至水. 将切片浸入10%甲苯胺蓝液1 min, 自来水清洗至肉眼未见染料附着. 继而将切片浸入90%乙醇分色, 显微镜下观察分色情况, 至紫红色颗粒清晰, 约30-60 s, 蒸馏水清洗1 min中止分色. 常规脱水、透明、封片. 应用Image-pro PLUS 4.1版图像分析软件, 每例切片随机选择3个视野, 光镜下观察, 放大20倍, 进行肥大细胞计数; (3)Western blot检测下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2蛋白表达: 应用Western blot法, 检测TPRV1、TPRV2蛋白表达(具体步骤: 蛋白制备-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳-转膜、封闭、抗原抗体反应-显色、检测分析); (4)实时荧光定量PCR检测下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA表达: 应用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR), 检测TPRV1、TPRV2 mRNA表达(具体步骤: 组织总RNA提取-Primer5.0软件设计引物-逆转录cDNA-Real time PCR反应体系扩增-目的基因相对mRNA表达水平的计算分析). 引物序列(GenBank上查找目的基因mRNA序列, 在CDS区设计特异性引物), 反应条件为: 93 ℃ 3 min, 然后93 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 共40循环(表1).

表1 TPRV1、TPRV2、GAPDH引物序列.

引物序列	上游	下游	扩增片段(bp)
TPRV1	5'-TTGGATTTTCCACAGCCGTAG-3'	5'-AGAGTTACCTGGCCTGCAGG-3'	113
TPRV2	5'-GGCATACACAGAAGGCTCCAC-3'	5'-TCCCTGTCAATCTGCAGCAG-3'	108
GAPDH	5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'	5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'	73

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1.2.3 大鼠内脏敏感性检测: (1)评估大鼠的腹部撤离反射(abdominal withdrawal reflex, AWR): 采用直结肠扩张法(colorectal distension, CRD)刺激[6], 乙醚麻醉下, 将石蜡油润滑后的动脉栓子清除术导管经肛门插入, 气囊末端距离肛门1 cm. 用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起, 固定气囊. 大鼠苏醒后, 将其放在特制的透明塑料笼内, 大鼠在此笼内只能前后运动, 不能转身. 30 min后待大鼠适应环境后, 逐渐注气扩张肠道, 分别观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量阈值, 进行评估. 用AWR行为评分, AWR 1分看做是大鼠感觉容量阈值, 2分作为痛觉敏感阈值 4分作为痛觉最大耐受容量阈值; (2)评估大鼠的腹壁紧张度[7]: 每组随机挑选3只大鼠, 用苯巴比妥(30 mg/kg)麻醉, 将一银制双极电极缝合到腹股沟韧带上方、距中线1.5 cm的一侧腹外斜肌上. 电极的游离端经皮下隧道置于颈后, 用胶布固定. 手术后5 d开始肌电记录. 乙醚麻醉下, 将上述球囊导管经肛门插入直肠内, 球囊末端距离肛门1 cm, 电极导线的两端连接电生理记录仪. 大鼠苏醒30 min后, 分别在0、0.4、0.8、1.2和1.6 mL不同容量下进行直肠扩张. 每次膨胀持续5 min, 记录5 min内腹壁收缩数量, 每次扩张结束时, 将水回抽, 检测球囊有无漏水. 用Power Lab电生理记录仪记录腹壁肌电活动, 高频滤过设置在10 Hz, 低频滤过在1 kHz, 电压在1 mV. 肌电活动增高超过基线水平100 μV以上认为是一次有意义的腹壁收缩活动.

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 用SPSS11.5 For Windows One-way Analysis Of Variance(One-way ANOVA)进行多组间方差分析, 方差齐时用LSD法, 方差不齐时用Tambane'S T2法.

2 结果

2.1 大鼠一般情况变化

正常组大鼠体质量明显增加, 大便正常, 耗食量正常; 造模大鼠均出现不同程度体质量增长缓慢或下降, 自第2天始出现大便次数增多、稀便、肛门口污秽、拱背、萎靡、蜷卧少动、喜聚堆等表现.

2.2 大鼠内脏敏感性检测

2.2.1 大鼠腹部回缩反射: 正常组引起大鼠腹部抬高和背部拱起的扩张容量阈值分别为0.72 mL±0.08 mL和1.14 mL±0.12 mL; 模型组腹部抬高和背部拱起阈值分别为0.38 mL±0.03 mL和0.57 mL±0.06 mL(表2).

表2 大鼠腹部回缩反射腹部撤离反射评分比较(n = 20, mean±SD, mL).

分组	腹部抬高	背部拱起
正常组	0.72±0.08	1.14±0.12
模型组	0.38±0.03^a	0.57±0.06^a

^aP<0.05 vs 正常组.

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2.2.2 大鼠腹壁紧张度: 球囊无扩张时, 大鼠腹壁外斜肌通常无肌电活动, 5 min记录期间内由于大鼠偶尔身体移动, 会记录到幅度较小的腹壁收缩反应. 在0.4 mL容量时, 正常组腹壁收缩并不明显, 模型组腹壁收缩数目达4.27次/5 min±0.21次/5 min, 有统计学意义(P<0.05). 0.8 mL扩张容量下, 模型组腹壁收缩活动均较正常组显著增高, 收缩数目达8.43次/5 min±1.15次/5 min(P<0.05). 1.6 mL扩张容量下所有大鼠的腹壁收缩数目差异均无显著性(P>0.05, 表3).

表3 不同浓度下大鼠腹壁紧张度评分比较 (n = 20, mean±SD, mL).

分组	0.4 mL	0.8 mL	1.6 mL
正常组	0.53±0.12	3.12±1.01	17.58±4.31
模型组	4.27±0.21^a	8.43±1.15^a	18.14±5.26^a

^aP<0.05 vs 正常组.

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2.3 大鼠组织病理学变化

模型组大鼠结肠HE染色, 镜下提示结肠壁各层结构均未见明显异常改变, 偶见结肠黏膜下层轻度血管扩张, 少量炎细胞浸润. 与正常组比较, 无明显差异(图1).

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图1 肠易激综合征病理结果(×10). A: 模型组; B: 正常组.

2.4 大鼠甲苯胺蓝染色肥大细胞表达

甲苯胺蓝染色法结果表明, 镜下见MC胞浆被染成紫红色, 胞核呈蓝色, 散布于黏膜层和黏膜下层的小血管周围, 细胞呈圆形或梭形或形状不规则, 紫红色颗粒围绕细胞核散在分布或呈不规则形状, 其中脱颗粒者胞膜破裂, 有颗粒涌出, 细胞不规则; 未脱颗粒者胞膜完整, 胞质均匀. 与正常组比较, 模型组MC活化数目显著增多(图2).

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图2 肠易激综合征甲苯胺蓝染色肥大细胞表达结果(×20). A: 模型组; B: 正常组.

2.5 IBS下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA表达

正常组下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA表达分别为TPRV1(0.37±0.11, 0.39±0.07, 0.45±0.04); TPRV2(0.52±0.10, 0.47±0.08, 0.59±0.09). 模型组下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA表达分别为TPRV1(1.06±0.12, 1.00±0.07, 1.43±0.23); TPRV2(1.15±0.16, 1.09±0.09, 1.29±0.14), 两组比较有统计学意义(P<0.05)(图3).

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图3 肠易激综合征下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA表达. A: TPRV1样本扩增曲线图; B: TPRV1样本溶解曲线图.

2.6 IBS下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2蛋白表达

正常组下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 蛋白表达, 分别为TPRV1(0.23±0.01, 0.31±0.03, 0.52±0.08); TPRV2(0.21±0.01, 0.43±0.04, 0.37±0.07). 模型组下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 蛋白表达分别为TPRV1(0.56±0.05, 0.67±0.03, 1.32±0.12); TPRV2(0.69±0.06, 0.72±0.04, 1.27±0.17), 有统计学意义(P<0.05)(图4).

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图4 肠易激综合征-D下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2蛋白表达. A: TPRV2样本扩增曲线图; B: TPRV2样本溶解曲线图.

3 讨论

流行病学资料表明[8], 发达国家普通人群中IBS发病率很高, 英国、美国人群IBS患病率为5%-25%. 国内学者在北京地区的调查发现[9], 符合Manning标准和Rome标准校正后的IBS人群患病率分别为7.01%和0.82%. 广州市居民IBS患病率为5.6%, 普通门诊及消化专科门诊中IBS所占比例分别为10.1%、34.3%. 女性高于男性, 便秘型占27.0%, 腹泻型占62.3%, 其他型占9.8%[10]. IBS目前发病机制尚未明确, 因而尚缺乏有效针对性的治疗手段, 由此每年因此而耗费数百亿元[11]. 依据罗马Ⅲ标准, 腹痛或腹部不适是诊断IBS的必备条件, 而内脏敏感性增高时腹痛或腹部不适的主要病理基础[12], IBS究其发病的重要病理机制目前主要是内脏敏感性增高, 其中脑肠互动在IBS发病中占据关键地位. TPRV1、TPRV2作为重要的神经递质参与内脏疼痛信号转导的作用不容忽视[13].

TPR(辣椒素受体)家族是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一个配体门控非选择性阳离子通道, 可被辣椒素、H⁺和伤害性热刺激(>43 ℃)激活[14]. TPRV1是一种多型信号探测器及多种疼痛刺激的整合器, 主要分布在背根神经中, 可以被多种炎症介质激活, 如: 生长因子、神经递质、肽类物质、小分子蛋白、类脂、化学增活素及细胞增活素等, 在痛觉的产生和内脏痛觉敏感性增强中扮演重要角色[6,15]. 蛋白水解酶可通过激活蛋白酶激活型受体2、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途径增强TRPV1的敏感性, 结肠内给药, 引起内脏痛觉过敏. TPRV2主要分布在感受伤害性热和机械刺激的有髓Aδ神经和少部分C神经纤维中, 与TPRV1有50%的同源性, 与炎症引起的痛觉增敏可能相关[16,17]. 本研究发现, IBS下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA及其蛋白表达呈上升趋势, 与正常组比较, 有统计学意义; 上述指标变化与内脏敏感性增高呈正相关. 我们认为辣素受体升高可能通过增进内脏疼痛感觉从而影响肠道运动, 导致腹痛、腹泻等症状发生.

总之, TPR通道在内脏痛觉感受和增敏机制占据重要地位, 以TPRV1、TPRV2拮抗为靶点开展药物研究, 将有望为IBS防治提供新的思路.

背景资料

内脏敏感性在肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)发病中占据关键地位已为消化专家所共识, 我们发现TPRV1作为配体门控非选择性阳离子通道受体, 在疼痛传导中至关重要, 基于上述研究角度出发, 探讨TPRV1表达在IBS发病中的意义, 将有望为IBS的防治提供新的靶点.

同行评议者

杜群, 副研究员, 广州中医药大学脾胃研究所药理室

研发前沿

本研究发现IBS下丘脑-垂体-结肠TPRV1、TPRV2 mRNA及其蛋白表达呈上升趋势, 我们认为辣素受体升高可能通过增进内脏疼痛感觉从而影响肠道运动, 导致腹痛、腹泻等症状发生. 通过阻断辣素受体通道对于缓解疼痛无疑是有利的.