研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2013-10-28; 21(30): 3247-3251
在线出版日期: 2013-10-28. doi: 10.11569/wcjd.v21.i30.3247
黄连素、大黄素、五味子及黄芩苷对幽门螺杆菌多重耐药株的体外抑菌作用
吴明慧, 黄衍强, 黄赞松, 周喜汉, 喻文强, 苏建伟
吴明慧, 广西医科大学研究生学院 广西壮族自治区南宁市 530021
黄衍强, 右江民族医学院微生物学和免疫学教研室 广西壮族自治区百色市 533000
黄赞松, 周喜汉, 喻文强, 苏建伟, 右江民族医学院消化疾病研究所 附属医院消化内科 广西壮族自治区百色市 533000
吴明慧, 在读硕士, 主要从事消化系统疾病的研究.
基金项目: 广西自然科学基金资助项目, No. 2012GXNSFAA053172; 广西教育厅重点课题基金资助项目, No. 201202ZD078; 广西卫生厅课题基金资助项目, No. Z2010082.
作者贡献分布: 此课题由吴明慧、黄赞松及黄衍强设计; 研究过程由吴明慧、周喜汉、喻文强及苏建伟操作完成; 数据分析由吴明慧与黄衍强完成; 本论文写作由吴明慧与黄衍强完成; 黄赞松负责本课题的理论指导.
通讯作者: 黄赞松, 教授, 533000, 广西壮族自治区百色市城乡路98号, 右江民族医学院消化疾病研究所, 附属医院消化内科. 1019846481@qq.com
收稿日期: 2013-07-25
修回日期: 2013-08-03
接受日期: 2013-09-17
在线出版日期: 2013-10-28

目的: 研究黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷4种中药成分对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)多重耐药(multiple drug resistance, MDR)株的体外抑菌作用, 为临床上根除MDR株提供实验和理论依据.

方法: 临床分离培养46例H. pylori, 琼脂二倍稀释法测定阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑5种抗生素对临床分离株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC), 筛选出MDR株; 试管二倍稀释法检测4种中药成分黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷对MDR株的MIC, 比较分析不同中药对H. pylori多重耐药性的影响.

结果: 共筛选出6株MDR株, 4种中药成分对不同的菌株的MIC值不完全相同, 其范围分别为: 黄连素12.5 mg/mL, 大黄素MIC 50-200 mg/mL, 黄芩苷25-200 mg/mL, 五味子50-100 mg/mL.

结论: 4种中药成分黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷对体外MDR株均有一定的抑菌作用, 其中黄连素效果更显著.

关键词: 幽门螺杆菌; 多重耐药; 中药; 抑菌

核心提示: 本实验研究了常见的黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷4种中药成分对多重耐药幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)的体外抑制杀灭作用, 为探寻抗多重耐药H. pylori的中药制剂提供实验依据.
引文著录: 吴明慧, 黄衍强, 黄赞松, 周喜汉, 喻文强, 苏建伟. 黄连素、大黄素、五味子及黄芩苷对幽门螺杆菌多重耐药株的体外抑菌作用. 世界华人消化杂志 2013; 21(30): 3247-3251
In vitro bacteriostatic effect of berberine, emodin, schisandra, and baicalin on multidrug resistant strains of Helicobacter pylori
Ming-Hui Wu, Yan-Qiang Huang, Zan-Song Huang, Xi-Han Zhou, Wen-Qiang Yu, Jian-Wei Su
Ming-Hui Wu, Graduate College of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Yan-Qiang Huang, Department of Microbiology and Immunology, the Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Zan-Song Huang, Xi-Han Zhou, Wen-Qiang Yu, Jian-Wei Su, Institute of Digestive Disease, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by: the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2012GXNSFAA053172; the Key Project of Foundation of Education Department of Guangxi, No. 201202ZD078; the Scientific Research Foundation of Health Department of Guangxi, No. Z2010082.
Correspondence to: Zan-Song Huang, Professor, Institute of Digestive Disease, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, 98 Chengxiang Road, Baise 533000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. 1019846481@qq.com
Received: July 25, 2013
Revised: August 3, 2013
Accepted: September 17, 2013
Published online: October 28, 2013

AIM: To examine the in vitro bacteriostatic effect of berberine, emodin, schisandra, and baicalin on multiple drug resistant (MDR) strains of Helicobacter pylori (H. pylori) to provide an experimental basis for clinical killing of these MDR strains.

METHODS: After culturing and isolating forty-six H. pylori strains, the minimum inhibitory concentrations (MICs) of amoxicillin, clarithromycin, levofloxacin, tetracycline and metronidazole for the isolated strains were determined by agar dilution method to screen MDR strains. The MICs of berberine, emodin, schisandra, and baicalin for MDR strains were then determined.

RESULTS: Six MDR strains were identified. The MICs of berberine, emodin, schisandra, and baicalin for different MDR strains were not identical, and their ranges were: berberine 12.5 mg/mL, emodin 50-200 mg/mL, baicalin 25-200 mg/mL, and schisandra 50-100 mg/mL.

CONCLUSION: Each of berberine, emodin, schisandra, and baicalin has an appreciated inhibitory effect on MDR strains in vitro, and the effect of berberine is more significant.

Key Words: Helicobacter pylori; Multidrug resistance; Traditional Chinese medicine; Bacteriostasis
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)为定植于人胃黏膜的一种微需氧、螺旋状的革兰阴性杆菌, 已被公认为是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要病因, 并与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤的发生密切相关[1,2]. H. pylori感染率高, 并已出现了同时对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑3种或以上抗生素耐药的多重耐药(multiple drug resistant, MDR)株, 2009年Wueppenhorst等[3]研究显示, 临床分离的H. pylori中, 15%存在3种或3种以上的抗生素多重耐药; 2010年, 黄宏思等[4]报道同时对甲硝唑、克拉霉素和阿莫西林3种抗生素耐药率为3.74%, 导致H. pylori根除率下降. 抗生素耐药性及不良反应多是目前西药治疗H. pylori遇到的主要问题, 且H. pylori的耐药机制仍未阐明, 因此寻找安全有效, 不良反应少且无耐药性的药物治疗H. pylori感染, 是当前十分重要的研究课题. 中医药不良反应少, 药源丰富, 使用方便, 在治疗H. pylori感染中显示出独特的优越性, 具有广阔的运用前景. 本实验研究了常见的黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷4种中药成分对多重耐药H. pylori的体外抑制杀灭作用, 为探寻抗多重耐药H. pylori的中药制剂提供实验依据. 现报道如下.

1 材料和方法
1.1 材料

用于测定最低抑菌浓度的H. pylori菌株胃黏膜活检标本选取于54例确诊为消化性溃疡或慢性活动性胃炎患者(右江民族医学院附属医院消化内科胃镜室, 2011-10/2012-08), 每例取一块标本, 研磨后接种于含5%新鲜兔血的哥伦比亚血琼脂培养基, 37 ℃微需氧(850 mL/L N2、100 mL/L CO2、50 mL/L O2)相对湿度>98%的条件下培养3-5 d, 经生化反应(尿素酶、触酶、氧化酶)及HE染色、形态学鉴定, 确认是H. pylori, 共获得临床分离株46例. 本试验所使用的抗生素原药均由药厂提供: 阿莫西林批号110807, 四川制药制剂有限公司; 克拉霉素批号111202, 哈药集团制药六厂; 左氧氟沙星批号120120, 浙江医药股份有限公司新昌制药厂; 四环素批号20110902, 广东台城制药股份有限公司; 甲硝唑批号10091544, 浙江济民制药有限公司; 98%大黄素(批号120908)、97%黄连素(批号120810)、98%五味子(批号120908)、90%黄芩苷(批号120908)购自陕西昂盛生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 MDR株的筛选: 琼脂二倍稀释法测定5种抗生素对46例H. pylori的MIC, 参照美国临床实验室标准委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)操作步骤及标准[5,6]: 刮取培养24-72 h, 处于对数生长期的菌落溶于无菌生理盐水中, 调整浓度, 对比比浊管至0.5麦氏点, 每毫升菌液约含有108的菌落; 移液器吸取2 μL的菌液接种于分别含阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑的不同浓度的哥伦比亚琼脂表面, 微需氧环境中37 ℃培养72 h后观察结果, 能在含阿莫西林≥4 μg/mL、左氧氟沙星≥8 μg/mL、克拉霉素≥1 μg/mL、甲硝唑≥8 μg/mL、四环素≥4 μg/mL中的3种或3种以上抗生素的培养基上生长的菌株, 确定为MDR株.

1.2.2 试管二倍稀释法检测四种中药对MDR株的MIC: 参照文献[7]: 取无菌试管12支, 每支试管中加入脑心浸液液体培养基2 mL, 第一支试管加入中药供试液2 mL(预先用0.2 μm滤菌器滤过), 摇匀, 第1管内中药浓度为200 mg/mL, 倍比稀释至第10管. 各管内分别加入上述制备的H. pylori菌液0.1 mL(浓度为107-108 CFU/mL), 混匀后置微需氧发生袋中. 第11管不加药液只加菌液, 作为阴性对照, 第12管不加菌液不加药液作为阳性对照. 混匀后置微需氧发生袋中, 连同产气袋一起放置于适当大小的烧杯中, 保持试管直立状态, 37 ℃, 100 r/min的速度震荡培养72 h观察结果. 每种中药药敏试验重复3次, 取均值. 将上述的各管培养物取出0.5 mL溶液进行生化和涂片染色鉴定, 并传至新的非选择性哥伦比亚培养基, 培养3 d无细菌生长者判定为有抑菌作用, 能够抑制H. pylori生长的最小浓度为该供试药物的MIC值.

2 结果
2.1 MDR株筛选结果

共筛选出6株MDR株, 其编号及耐药性如表1, 由表1可以看出, 4株MDR株耐药性相似, 均表现为对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑耐药; 一株表现为对左氧氟沙星敏感, 对阿莫西林、克拉霉素、四环素、甲硝唑耐药; 一株表现为对阿莫西林、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑耐药.

表1 MDR株对5种抗生素的耐药性.
菌株左氧氟沙星阿莫西林克拉霉素四环素甲硝唑
6 S R R R R
28 R R R R R
38 R R R R R
40 R R R R R
41 R R R R R
42 R R I R R
R: 耐药, S: 敏感; I: 中介; 左氧氟沙星MIC≤2 μg/mL, 克拉霉素MIC 0.5 μg/mL.
2.2 4种中药成分对MDR株的MIC

由表2可以看出, 黄连素对幽门螺杆菌多重耐药株的MIC值最小且结果一致, 为12.5 mg/mL, 抑菌作用强, 而黄芩苷、大黄素、五味子对不同菌株的MIC值不完全相同.

表2 MDR株4种中药成分MIC测定结果 (mg/mL).
菌株黄连素黄芩苷大黄素五味子
6 12.5 25 200 100
28 12.5 50 200 50
38 12.5 50 50 100
40 12.5 100 100 100
41 12.5 100 100 100
42 12.5 25 100 50
3 讨论

中药药理学研究证实, 许多中药具有较强的抑制或杀灭H. pylori作用, 以清热解毒类为多, 被称为植物性抗生素[8]. 近年国内外研究显示, 众多的中草药, 如黄连、黄芩、穿心莲、大黄、吴茱萸、板蓝根、乌梅等在体外培养条件下, 对H. pylori具有一定的抑制和杀灭作用, 还可抑制对抗生素耐药的H. pylori生长或减少耐药菌株的产生[9-12], 而且通过调整全身和胃黏膜局部的屏障功能来有效改善各种H. pylori相关胃肠病的临床症状, 调节和提高机体免疫功能, 最终达到清除H. pylori感染的治疗效果[13].

研究表明, 黄芩苷是黄芩的主要有效成分, 具有广谱抗菌作用, 其抑菌机制包括破坏菌体细胞生物膜, 抑制细菌DNA、RNA、蛋白质的生物合成与降解内毒素等三方面[14]. 黄连素又名盐酸小檗碱, 是黄连主要成分, 其杀菌机制可能是抑制H. pylori的生长与呼吸, 抑制葡萄糖及糖代谢中间产物的氧化过程, 特别是脱氧反应, 从而杀灭细菌[12,15]. 大黄主要含蒽醌类化合物, 近年来发现的蒽醌类化合物主要包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等4种. 其中, 大黄素具有泻下、抗菌、抗肿瘤及止血等效用, 其抗菌作用可能与其抑制细菌核酸的生物合成和呼吸过程有关, 其能引起H. pylori DNA的损伤, 产生更小的DNA片段[16,17]; 但也有研究发现大黄素对H. pylori的抑制作用是通过芳香胺-N-乙酰转移酶的抑制作用实现的[18]. 目前暂未见有中药抑制H. pylori多重耐药株的相关研究报导.

从本实验可以看出, 黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷对多重耐药H. pylori都有一定的抑制杀灭作用, 尤以黄连素效果明显, 这与池志芳[19]、姜成等[20]研究结果一致, 但6个MDR株只有黄连素MIC稳定, 为12.5 mg/mL, 余3种中药成分其MIC值不完全一致, 分析可能原因为: (1)不同MDR株耐药性有一定的区别, 导致MIC不同; (2)中药抑菌效果不一致, 黄连素效果明显, 作用较稳定, 而其他3种中药成分效果不明显, 作用不稳定, 因菌株耐药性不同导致MIC不同. 由于中药抑制H. pylori的药敏试验目前国内外还没有统一的标准, 现多采用K-B纸片扩散法和液体倍比稀释法. 王绪霖等[21]观察到黄连、大黄、黄芩的抑菌环分别为25、24及25 mm, 姜成等[20]用打孔法测定黄连抑菌圈直径为33 mm, 大黄、黄芩的抑菌环直径均为22 mm; 琼脂稀释法测定黄连对幽门螺杆菌的MIC为12.5-25 mg/mL, 黄芩的MIC为25 mg/mL, 大黄MIC为50 mg/mL, 黄连的抑菌作用最强, 支持我们的研究结论. 吴静等[22]用试管二倍稀释法测定黄连素对H. pylori的MIC 0.025 g/mL, 与本实验结果基本一致; 同时他们还测定黄芩苷对H. pylori的MIC50值为1.04 mg/mL, MIC90值为1.30 mg/mL[7], 这与本实验结果不一致, 考虑可能为本实验均为多重耐药菌株, 且菌株来源不同, 包括地域、民族、性别等差异, 导致测定的最低抑菌浓度更大.

本实验表明黄连素、黄芩苷、大黄素、五味子均对幽门螺杆菌多重耐药菌株有一定的抗菌活性, 提示今后可以从中药材中开发出新一代抗H. pylori药物, 为中医药参与H. pylori治疗提供实验依据, 且为解决日趋严重的H. pylori多重耐药性问题提供新的思路.

评论
背景资料

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染率高, 且已出现多重耐药株, 抗生素耐药性及不良反应多是目前西药治疗H. pylori遇到的主要问题, 而中医药不良反应少, 药源丰富, 在治疗H. pylori感染中有独特的优越性, 因此寻找安全有效、不良反应少的中医药治疗多重耐药H. pylori感染是当前十分重要的研究课题.

同行评议者

袁建业, 副研究员, 上海中医药大学附属龙华医院/脾胃病研究所

研发前沿

目前研究发现临床分离的H. pylori抗生素耐药率较高, 中药成分对根除H. pylori感染有一定作用, 但中药成分对多重耐药H. pylori株有无抑制作用仍不明确.

相关报道

目前有报道黄连素、大黄素、五味子、黄芩苷等中药成分对H. pylori有杀灭作用, 为中医药参与H. pylori治疗提供实验依据, 且为解决H. pylori多重耐药性问题提供新的思路.

创新盘点

目前报道中药对H. pylori体外抗菌作用的研究有不少, 但关于中药成分对H. pylori多重耐药株的体外抑菌作用研究少见.

同行评价

本文首次对从中药中筛选抗多重耐药H. pylori有效药物进行了尝试, 具有较好的科学价值.

编辑:田滢 电编:闫晋利

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