下调缺氧诱导因子-1α表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的: 观察肝癌缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1alpha, HIF-1α)表达及靶向其基因转录对肝癌细胞增殖的影响.

方法: 以自身配对法收集术后肝癌及癌周组织, 免疫组织化学染色法分析HIF-1α胞内表达及分布; 按照HIF-1α基因序列合成miRNA, 筛选干扰效率最佳者转染肝癌(HepG2)细胞, 以荧光定量-PCR和Western blot分别检测HIF-1α转录和蛋白表达; 并以miRNA转染联合阿霉素后, 流式细胞仪检测沉默细胞中HIF-1α对HepG2细胞增殖的影响.

结果: 肝癌及癌周组织HIF-1α表达呈棕黄色颗粒状, 位于胞浆和部分胞核, 呈均匀表达, 中央静脉周围明显; 其阳性率癌组织为80%, 低于癌旁100%表达(χ² = 22.35, P<0.001); 与瘤体大小和分化程度相关; HepG2细胞经miRNA干扰后, HIF-1α在RNA和蛋白水平分别下降87%和56%, 发生细胞凋亡(22.46%±0.61%)和G₁期阻滞(61.49%±1.12%, P<0.01); 加入阿霉素后细胞凋亡率和G₁期细胞分别增至36.99%±0.88%和65.68%± 0.91%.

结论: HIF-1α过表达与肝癌密切相关, 以特异性miRNA靶向HIF-1α, 可调控细胞周期, 通过加速凋亡的机制抑制癌细胞增殖.

关键词: 肝癌; 缺氧诱导因子-1α; miRNA; 基因沉默; 增殖抑制

核心提示: 肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma)血供丰富, 传统疗法易耐受, 预后极差. 肝癌细胞增殖失控导致局部缺氧, 激活缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α), 进而增强血管新生、促进癌细胞增殖及转移, 抑制细胞凋亡和分化. 本研究分析了肝癌及癌周组织HIF-1α表达, 并以miRNA或联合阿霉素在体外干扰细胞中HIF-1α表达, 观察肝癌细胞凋亡和增殖周期的变化, 发现肝癌组织内HIF-1α表达水平异常升高, 其表达增强与癌周围组织的增生活跃密切相关. 沉默HIF-1α可逆转缺氧引起的HIF-1α升高, 控制癌细胞增殖, 可作为一种辅助策略应用于肝癌的治疗.

Down-regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha expression inhibits cell proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

Li Wang, Min Yao, Xing Gu, Yun Shi, Li-Wei Qiu, Shao-Lin Lu, Deng-Fu Yao

Li Wang, Min Yao, Xing Gu, Yun Shi, Li-Wei Qiu, Shao-Lin Lu, Deng-Fu Yao, Research Center of Clinical Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Supported by: the Chinese Postdoctoral Science Foundation No. 2012M521108; and the International S and T Cooperation Program of China, No, 2013DFA32150.

Correspondence to: Deng-Fu Yao, Professor, Research Center of Clinical Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, 20 Xisi Road, Nantong 226001, Jiangsu Province, China. yaodf@ahnmc.com

Received: April 23, 2013
Revised: May 28, 2013
Accepted: September 9, 2013
Published online: October 8, 2013

Abstract

AIM: To detect the expression of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1α) in human hepatocellular carcinoma and to observe the effect of silencing HIF-1α gene on the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells.

METHODS: Hepatocellular carcinoma tissue samples and matched tumor-adjacent tissue samples were collected to detect the expression and cellular distribution of HIF-1α by immunohistochemistry. HIF-1α-specific miRNAs were synthesized and screened. After HepG2 cells were transfected with a miRNA, the expression of HIF-1α mRNA and protein was determined by real time-PCR and Western blot, respectively. Cell cycle progression and apoptosis were quantitatively analyzed by flow cytometry and annexin V-FITC/PI double dyeing assay.

RESULTS: HIF-1α was distributed mainly in the cytoplasm and less in the nucleus, which was especially prominent around the central vein. The positive rate of HIF-1α expression was significantly lower in hepatocellular carcinoma than in tumor-adjacent tissue (80% vs 100%, χ² = 22.35, P < 0.001). HIF-1α expression was correlated with tumor size and differentiation degree. After HepG2 cells were transfected with a miRNA, HIF-1α expression was down-regulated in a time-dependent manner, the apoptosis rate increased significantly (P < 0.01), and HepG2 cells were significantly arrested at G1 phase (proportion of cells in G₁ phase: 61.49% ± 1.12%, P < 0.01). In the presence of doxorubicin, the apoptosis rate and the proportion of cells in G1 phase were increased to 36.99% ± 0.88% and 65.68% ± 0.91%, respectively.

CONCLUSION: Abnormal HIF-1α expression is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Silencing HIF-1α gene efficiently inhibits the proliferation of hepatocellular carcinoma cells possibly by regulating cell cycle progression and apoptosis.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; HIF-1α; miRNA; Gene silencing; Proliferation inhibition

0 引言

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一多基因、多阶段发生、血供丰富、传统疗法易耐受、预后极差、高度恶性的实体瘤[1,2]. 肝癌细胞增殖失控导致无效或畸形血供增加, 在慢性肝损伤、肝硬化、肝癌演变过程中, 正常脉管系统破坏, 共同导致局部缺氧[3]. 肝组织缺氧微环境, 激活缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α), 促使其进入细胞核内与HIF-b异二聚体化, 结合于百余种下游靶基因, 发挥一系列细胞适应性调节, 从而增强血管新生、癌细胞增殖及转移、对放化疗耐受、抑制细胞凋亡和分化[4,5]. HIF-1α是介导生理性和病理性低氧反应的关键转录因子, 在缺氧环境中表达相对显著, 在转录水平调控细胞增殖, 调控血管新生"开关基因", 激活许多缺氧反应性基因表达, 与肿瘤的生长、转移和预后等密切相关[6,7]. 本文分析了肝癌及癌周组织HIF-1α表达, 并以miRNA在体外干扰肝癌细胞HIF-1α表达, 或联合阿霉素观察对肝癌细胞凋亡和增殖周期的变化, 以探讨干扰HIF-1α活化对肝癌细胞的增殖抑制作用与机制.

1 材料和方法

1.1 材料

35例肝癌组织取自南通大学附属医院2012-03/2012-12肝癌手术标本, 标本切下后经40 g/L甲醛溶液固定、取材、石蜡包埋保存, 均经病理学检查证实为肝细胞癌, 其中高分化8例、中分化22例、低分化5例; 男30例, 女5例; 年龄35-69岁, 平均51岁±9.19岁. 癌灶直径为1.0-12.0 cm, 中位数4.65 cm±2.96 cm. 肿瘤单发者28例, ≥2个者7例. 所有病例均有完整随访资料, 按全国肝癌防治协作组制定的标准核实诊断. 鼠抗人 HIF-1α单克隆抗体(Abcam, 英国); 双荧光素酶报告基因、pGL3及pRL-TK(Promega, 美国); Annexin-V FITC凋亡检测试剂盒、FuGENE HD转染试剂(Roche, 德国); Premix Taq酶、DNA Marker、T4连接酶、Xho-Ⅰ、Hind-Ⅲ及SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa, 日本); RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas, 立陶宛); pcDNA™6.2-GW/ EmGFPmiR载体、载体构建盒BLOCK-iT™含EmGFP的Pol Ⅱ miR RNAi表达载体(Invitrogen, 美国); DYEnamic ET Dye测序(Amersham Biosciences, 美国); Top10感受态细胞(百奥生物); 鼠抗人β-actin一抗、HRP-羊抗鼠二抗、SDS-PAGE、彩色预染蛋白标准、PVDF膜、BCA蛋白、质粒抽提盒(碧云天生物技术有限公司).

1.2 方法

1.2.1 肝总RNA制备与浓度分析: 称取肝组织50 mg, 置于无RNase的匀浆器中, 加入RNA快速制备试剂(TRIzol)1.0 mL匀浆2 min, 在匀浆液中加氯仿混匀冻存, 高速离心, 上清液中加入等量异丙醇混匀, 再离心并经预冷乙醇洗涤, 弃上清至室温5 min, 加入TE缓冲液置60 ℃水浴10 min, 取出置于-85 ℃冰箱保存备用. 取RNA提取液置微量比色皿中, 于岛津UV-2201型紫外分光光度计上检测RNA吸光度A260, 并换算总RNA浓度(μg/mg组织).

1.2.2 免疫组织化学分析: 采用二步法免疫组织化学检测法, 按照操作说明进行. 组织切片常规脱蜡及水化后, 以EDTA缓冲液冲洗后微波修复10 min. 加入HIF-1α一抗, 室温孵育1 h, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后加入聚合体增强剂, 室温孵育20 min, PBS清洗切片3次后再加入二抗, 室温孵育30 min, PBS洗涤3次后经0.1%DAB显色5 min, 自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片. 实验以PBS代替一抗作阴性对照. 阳性标准以已知表达HIF-1α的乳腺癌组织作阳性对照, 以组织中显示棕黄色颗粒为HIF-1α染色阳性. 阳性细胞计数: 每份标本切片选取5个高倍镜视野(×400)作阳性细胞计数, 按阳性细胞(清晰棕黄色染色)所占比例数分为: HIF-1α染色阴性(-), 阳性细胞数<10%; HIF-1α染色弱阳性(+), 10%-25%; HIF-1α染色中等阳性(++), 阳性细胞数在26%-50%; HIF-1α染色呈强阳性(+++), 阳性细胞数>50%.

1.2.3 细胞培养: 肝癌细胞株(HepG2, 南京凯基)常规复苏后, 以RPMI 1640完全培养液(含1%非必需氨基酸), 37 ℃, 50 mL/L CO₂及100%湿度的条件下培养, 传代, 取对数生长期细胞分析.设空白、阴性和干扰组, 检测细胞凋亡及周期时, 另加两组分别为阿霉素组(0.5 μmol/L)和干扰联合阿霉素组(0.5 μmol/L), 每组均设 3个复孔. 空白组常规培养; 阴性组添加阴性质粒和转染试剂培养; 干扰组加靶向HIF-1α载体和转染培养. 于转染后 24、48和72 h收集细胞.

1.2.3 miRNA设计: 人HIF-1α mRNA序列(NM_001530), 用Invitrogen miRNA设计系统软件设计4对miRNA寡聚单链DNA. 将4对oligo各自退火成双链. 然后用载体构建试剂盒BLOCK-iT™ Pol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP(Invitrogen公司)进行重组克隆, 将双链的miRNA oligo各自插入到miRNA表达载体pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR中, 构建miRNA质粒, 筛选干扰效率最佳一对序列为5'-TGCTGTAAAGCATCAGGTTCCTTCTTGTT TTGGCC ACTGACTGACAAGAAGGACTGATGCTTTA-3'和5'-CCTGTAAAGCA TCAGTC CTCT TGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGAAGGAACCTGATGCTTT AC-3', 其中加下划线部分为靶区序列, 其上下游为茎环结构.

1.2.4 细胞转染: FuGENE HD转染试剂转染 HepG2细胞. 转染前24 h每孔接种2 mL细胞悬液, 浓度为1×10⁵/mL, 使转染时细胞密度达80%-90%. 每孔加转染试剂和干扰载体, RPMI 1640完全培养补至100 μL, 室温静置15 min, 以形成干扰载体与转染试剂稳定复合物. 吸弃培养液, PBS洗两遍, 加入干扰载体与转染试剂稳定复合物, 加完全培养补至2 mL, 晃匀, 培养, 于转染后24、48和72 h取细胞备用.

1.2.5 干扰效率检测: 以QuickGene RNA culture cell试剂盒于核酸自动提取仪(Fujifilm, 日本)提取总RNA. 利用第一链cDNA合成试剂盒(ReverAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit)经RT-PCR生成相应的cDNA.以各组cDNA作为模板, 利用染料法进行Real-time PCR, 目标片段扩增引物HIF-1α-F和HIF-1α-R的序列分别为5'-CCACTGCCACCACTGATGAA-3'(nt 2254-2273)和5'-TTGGTGA GGCTGTCCGACTT-3'(nt 2412-2431), 产物大小178 bp, 退火温度为60 ℃, 延伸循环数为40. 根据相对定量法计算目标片段的扩增比例, mRNA的相对变化量公式为: Ratio = 2^-△△Ct. 以GAPDH作为内参, 各样本重复3次.

1.2.6 Western blot分析: 制作10%分离胶, 蛋白40 μg, 加上样缓冲液, 沸水浴后上样, 恒压80 V×35 min, 后100 V×60 min. 结束后转膜, 封闭. 取膜用TBS-T漂洗, 加鼠抗人HIF-1α(1:500), 4 ℃过夜, 漂洗, 加入HRP标记羊抗鼠 IgG(1:1000)二抗, 孵育2 h, 漂洗、DAB显色并摄相.

1.2.7 Annexin V-FITC/PI法分析: 常规消化, 接种, 培养, 根据设计加入相应试剂. 转染加阿霉素, 分别于48、72 h后, 收集细胞, 离心, 洗涤. 加入Annexin V-FLUOS/PI混合液, 重悬细胞, 避光, 流式细胞仪进行检测.

1.2.8 细胞周期: 常规消化细胞, 接种, 培养后弃培养基, 根据设计加入相应试剂, 转染后加阿霉素, 收集细胞, 固定, 洗涤, 加碘化丙啶混合液, 避光, 过300目筛网, 以488 nm波长为激发光检测, Macguit软件分析细胞周期.

统计学处理 数据以mean±SD表示, 样本均数间的比较采用方差分析, 两两比较采用q检验. 用SPSS13.0统计软件包处理、分析数据. 以P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 肝癌组织HIF-1α表达与定位

免疫组织化学显示肝癌及癌周组织HIF-1α阳性表达呈棕黄色, 颗粒状, 主要定位于胞浆中, 部分位于胞核. 癌组织HIF-1α表达均匀, 坏死区周围及浸润边缘HIF-lα表达增多(图1A). 癌旁近肿瘤边缘被压扁的组织条索中及中央静脉周围HIF-1α表达明显(图1B). 肝癌HIF-1α呈阳性表达28例占总数80%(+)-(++), 20%(7/35)未见表达; 癌周组织HIF-1α全数表达, 中等以上强度(++)-(+++)占71.4%(25/35), 癌周表达明显高于癌组织(χ² = 22.35, P<0.001, 表1). HIF-1α表达强度与分化程度负相关, 高分化<中分化<低分化(P<0.05), 与肿瘤数目、HBsAg感染间均未见明显相关.

表1 肝癌及癌周组织总RNA及HIF-1α表达的分析 ( n = 35).

分组	总RNA(µg/mg)	HIF-1α(强度)				阳性n(%)
	(mean± SD)	-	＋	＋＋	＋＋＋
癌灶	12.4 ± 7.3	7	21	7	0	28(80.0)
癌旁	53.8 ± 52.0b	0	10	18	7	35(100)b

^bP<0.01 vs 癌灶. HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

图1 肝癌及癌旁组织HIF-1α表达的免疫组织化学分析(×200). A: 肝癌; B: 癌旁. HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

2.2 HIF-1α miRNA转染与鉴定

HIF-1α miRNA干扰质粒转染HepG2细胞, 于转染后24 h镜下观察, 成功转染的HepG2细胞发绿色荧光, 转染效率达45%(图2).

图2 HIF-1α miRNA转染HepG2细胞荧光显微镜观察(×10). A: 荧光显微镜图; B: 同一视野普通光镜图; C: 融合图. HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

2.3 miRNA抑制HIF-1α基因转录

miRNA干扰HepG2细胞在转录水平上对HIF-1α表达抑制如表2. 与空白组相比, 转染HIF-1α miRNA后24、48和72 h, HepG2细胞中HIF-1α mRNA表达量(2^-△△Ct)分别减少为0.69, 0.39和0.13, 抑制率分别为31%, 61%和87%(P值分别为0.007, 0.000和0.000); 且干扰效率依次递增(P<0.001). miRNA干扰后HIF-1α基因相对定量与效率如表3. 阴性组抑制率未见明显统计学差异. 阴性组抑制率分别为9%、7%和17%, 与空白组相比未见统计学明显差异(P值分别为0.297, 0.356和0.060).

表2 HIF-1α干扰后基因的Ct与△Ct值变化与比较 ( n = 3).

分组	24 h			48 h			72 h
	CtHIF-1α	CtGAPDH	△Ct	CtHIF-1α	CtGAPDH	△Ct	CtHIF-1α	CtGAPDH	△Ct
空白	19.20	14.70	4.50	16.30	13.20	3.10	16.80	13.60	3.20
	19.30	14.80	4.50	16.00	12.90	3.10	16.80	13.20	3.60
	19.50	14.80	4.70	16.20	12.70	3.50	17.00	13.40	3.60
阴性	17.90	13.50	4.40	16.60	13.50	3.10	18.80	15.20	3.60
	18.30	13.30	5.00	16.70	13.00	3.70	18.80	15.00	3.80
	18.10	13.40	4.70	16.50	13.30	3.20	19.20	15.40	3.80
干扰	18.90	13.60	5.30	18.50	13.80	4.70	23.10	16.80	6.30
	18.90	13.80	5.10	18.30	13.60	4.70	23.50	16.70	6.80
	18.90	14.00	4.90	18.00	13.60	4.40	23.20	17.10	6.10

△Ct = Ct(HIF-1α)-Ct(GAPDH). HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

表3 miRNA干扰后HIF-1α基因相对定量与效率 ( n = 3).

分组	24 h			48 h			72 h
	△Ct均值	△△Ct	2-△△Ct	△Ct均值	△△Ct	2-△△Ct	△Ct均值	△△Ct	2-△△Ct
空白	4.57	0.00	1.00	3.23	0.00	1.00	3.47	0.00	1.00
阴性	4.70	0.13	0.91	3.30	0.10	0.93	3.73	0.27	0.83
干扰	5.10	0.53a	0.69	4.60	1.37	0.39ac	6.40	2.93	0.13ace

^aP<0.05 vs 组内空白组;

^cP<0.05 vs 24 h干扰组;

^eP<0.05 vs 48 h干扰组. △△Ct = △Ct_样本-△Ct_空白, 2^-△△Ct即为各组相对于空白组的干扰效率. HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

2.4 miRNA抑制HIF-1α蛋白表达

miRNA对HepG2细胞HIF-1α蛋白表达的抑制作用如图3. 与空白组比, 转染HIF-1α miRNA干扰载体 48、72 h后HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达明显减少(图3A), HIF-1α与b-actin灰度扫描比值显示HIF-1α表达量分别减少为空白组的0.85、0.41、0.35, 抑制率为15%、59%、65%(P值分别为0.024、0.000和0.000); 且蛋白表达率依次递减(P<0.05). 阴性组与空白组间未见明显统计学差异(图3B).

图3 miRNA转染HepG2细胞HIF-1α蛋白表达. A: 24 h(1、2、3)、48 h(4、5、6)和72 h(7、8、9)的空白、阴性和干扰组; B: HIF-1a与β-actin灰度扫描比值, ^aP<0.05 vs 空白组; ^cP<0.05 vs 24 h组; ^eP<0.05 vs 48 h组. HIF-1α: 缺氧诱导因子-1α.

2.5 miRNA联合阿霉素对癌细胞增殖的影响

2.5.1细胞周期改变: miRNA转染HepG2细胞48和72 h后, HepG2细胞周期时相均发生改变(表4). 干扰组G₀/G₁期比例明显高于空白组和阴性组(P<0.000), S期比例低于空白组和阴性组(P<0.000). 转染后48 h, 联合阿霉素组较阿霉素组G₀/G₁期比例增高(q = 0.10, P = 0.045), S期比例减低(q = 2.24, P = 0.049); 转染后72 h, 联合阿霉素组较阿霉素组G₀/G₁期比例同样增高(q = 4.50, P = 0.001), S期比例减低(q = 2.48, P = 0.033); 阴性组与空白组间未见统计学明显差异. 而G₂/M期比例, 各组间均未见统计学明显差异.

表4 miRNA转染HepG2细胞周期时相的影响 (%).

分组		空白	阴性	miRNA	阿霉素	阿霉素+miRNA
48 h	G0/G1	37.91±2.05	40.12±1.64a	54.78±1.64a	57.48±0.71a	60.32±1.20ade
	S	46.48±2.44	43.75±2.10a	28.43±0.76a	27.31±1.32a	24.24±1.88ace
	G2/M	15.61±0.72	16.13±0.68	16.79±1.93	15.21±0.77	15.44±1.13
72 h	G0/G1	56.75±1.13	57.43±1.27a	61.49±1.12a	61.95±0.42a	65.68±0.91adf
	S	26.14±0.78	25.56±1.21a	22.40±0.58a	21.62±1.19a	19.47±1.34ace
	G2/M	17.11±0.36	17.01±0.26	16.11±1.41	16.43±1.61	14.85±2.07

^aP<0.05 vs 空白组, G₀/G₁期q_{48 h} = 4.47, q_{72 h} = 5.50;

^dP<0.01 vs miRNA组, S期q_{48 h} = 3.51, q_{72 h} = 3.48,

^cP<0.05 vs miRNA组, G₀/G₁期q_{48 h} = 3.54,

^eP<0.05, q_{72 h} = 4.50;

^fP<0.01, S期q_{48 h} = 2.24, q_{72 h} = 2.48; ^eP<0.05 vs 阿霉素组.

2.5.2 促进肝癌细胞凋亡: miRNA转染HepG2细胞48和72 h后, HepG2细胞凋亡率均明显增加(表5); 转染后48 h干扰组凋亡率为15.49%±0.99%, 阿霉素组凋亡率为15.91%±0.37%, 两者未见显著统计学差异, 而两者联合组凋亡率达27.33%±0.94%, 显著高于单用阿霉素组(q = 22.90, P<0.001); 72 h联合组凋亡率呈现同样改变(q = 13.74, P<0.001); 阴性组与空白组间未见显著统计学差异.

表5 miRNA转染促进HepG2细胞凋亡.

分组	48 h凋亡(%)	q值	P值	72 h凋亡(%)	q值	P值
空白	3.80±0.12			8.01±0.71
阴性	4.84±0.23	2.10	0.062	9.38±0.44	1.34	0.081
miRNA	15.49±0.99a	23.65	0.000	22.46±0.61a	14.44	0.000
阿霉素	15.91±0.37a	24.50	0.000	27.52±1.31a	19.51	0.000
阿霉素+miRNA	27.33±0.94abd	47.40	0.000	36.99±0.88abd	28.98	0.000

^aP<0.05 vs 空白组; q_{48 h} = 23.75, q_{72 h} = 21.10,

^bP<0.01 vs miRNA组; q_{48 h} = 22.90, q_{72 h} =13.74,

^dP<0.01 vs 阿霉素组.

3 讨论

肝癌组织内HIF-1α表达水平异常升高, 肝癌组织及其周围组织中HIF-1α阳性表达呈棕黄色, 颗粒状, 主要定位于胞浆中, 部分位于胞核. 肝癌发生发展的早期阶段, HIF-1α在转录和蛋白水平上过表达, 癌前和癌变阶段在基因和蛋白表达上呈动态梯度增高[8]. 在人HCC癌灶组织中, 肿瘤坏死区周围及肿瘤浸润边缘HIF-lα表达增多; 癌旁组织中靠近肿瘤边缘被压扁的肝组织条索中及中央静脉周围HIF-1α表达明显, 癌周组织表达明显强于癌灶组织[9], 提示HIF-1α表达增强与癌周围组织的增生活跃密切相关.

HIF-1α调控VEGF和Ang-2[10,11]. 干扰HIF-1α后下调VEGF、Ang等, 显著抑制血管新生, 阻断肿瘤进展[12]. 干扰HIF-1α后, 随时间延长, HepG2细胞凋亡率逐渐增加, 且G₁期细胞明显增多, S期细胞显著减少, 阻断细胞有丝分裂, 从而抑制细胞增殖. 斯钙素(STC-2)启动子序列含有2个HIF-1α的结合位点, HIF-1α介导STC-2过表达可上调cyclin D的表达, 推动细胞G1/S期转变, HIF-1α下调后STC-2表达也随之下调[13]. HIF-1α诱导髓样细胞因子、磷酸腺苷反应元件结合蛋白过表达, 降低Bax/Bcl-2比值, 抵抗凋亡; 干扰HIF-1α、bcl-2、bcl-xl下调, 抗凋亡能力减弱[14].

HIF-1α可诱导癌细胞周围间质成纤维细胞发生自噬, 实体瘤内巨噬细胞大量浸润及局部缺氧, 缺氧促使巨噬细胞介导的T细胞功能抑制效应增强, 靶向干扰巨噬细胞中HIF-1α, 明显抑制了移植瘤的生长[15]. 丝氨酸/苏氨酸激酶-15(STK-15)是细胞周期的重要调节因子、HIF-1α下游靶基因, 可编码一种中心体复制相关激酶, 并具高水平的酪氨酸激酶活性, 参与调节、G₂/M期转换等, 干扰HIF-1α后, STK-15明显减少[16]. 阻断HIF-1α活化, 可显著增强化疗敏感性, 抑制肿瘤生长. HIF-1α可上调多重耐药基因mdr1, 下调Bax、caspase3表达, 抑制P53活性, 参与耐药形成; 干扰后可增强化疗药物诱导的凋亡, 逆转其化疗耐药[17,18]. HIF-1下调后, 提高化疗敏感性, 抑制肿瘤形成[19]. 阿霉素联合干扰, 凋亡率明显比单组高, 表明沉默HIF-1α可显著提高化疗敏感性.

TAE或TACE是晚期不可手术肝癌患者的疗法, 可阻断肿瘤血供引起坏死、萎缩, 但因造成缺氧, 诱导HIF-1α、VEGF等过表达, 导致侧支循环建立, 癌细胞逃逸, 残余癌迅速膨胀, 终使治疗失败[20]. 联合HIF-1α沉默, 可逆转TAE致缺氧引起的HIF-1α、VEGF和增殖核抗原升高, 控制血管新生和癌细胞增殖, 抑制残余癌生长, 加强TAE疗效. 且HIF -1α沉默, 可逆转放化疗耐受, 可作为一种辅助策略应用于肝癌的治疗, 具有应用前景[21].

评论

背景资料

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1alpha, HIF-1α)是介导生理性和病理性低氧反应的关键转录因子, 在缺氧环境中表达相对显著, 在转录水平调控细胞增殖, 调控血管新生"开关基因", 与肿瘤的生长、转移和预后等密切相关. 肝癌演变过程中, 正常脉管系统破坏, 共同导致局部缺氧, 激活HIF-1α, 从而增强血管新生, 促进癌细胞增殖及转移.

同行评议者

姜春萌, 教授, 大连医科大学附属第二医院消化科; 庄林, 主任医师, 昆明市第三人民医院肝病科

研发前沿

近年来对肿瘤血管新生的研究表明, 血管新生在肝癌的恶变、生长、转移等方面是至关重要的. VEGF是肿瘤诱导产生新生血管的最主要的细胞因子之一, 而HIF-1α则在基因水平上直接调控VEGF表达, 是恶性肿瘤诱导新生血管形成的一个主要调控因子. 目前对HIF-1α调控肝癌新生血管机制的分析是研究热点, 但如何利用这种机制来治疗肝癌尚缺乏深入研究.

相关报道

已有的研究表明, HIF-1α可调控VEGF和Ang-2, 影响血管生成; 而干扰HIF-1α后下调VEGF、Ang等, 显著抑制血管新生, 阻断肿瘤进展. 新近研究显示斯钙素(STC-2)启动子序列含有2个HIF-1α的结合位点, HIF-1α介导STC-2过表达可上调cyclin D的表达, 推动细胞G1/S期转变, HIF-1α下调后STC-2表达也随之下调.

创新盘点

本研究发现在人肝细胞性肝癌组织中, HIF-1α癌周组织表达明显强于癌灶组织, 提示HIF-1α表达增强与癌周围组织的增生活跃密切相关. 而通过miRNA或联合阿霉素沉默HIF-1α, 可逆转缺氧引起的HIF-1α升高, 控制癌细胞增殖.

应用要点

TAE或TACE是晚期不可手术肝癌患者的疗法, 可阻断肿瘤血供引起坏死、萎缩, 但因造成缺氧, 诱导HIF-1α、VEGF等过表达, 导致侧支循环建立, 癌细胞逃逸, 残余癌迅速膨胀, 终使治疗失败. 联合HIF-1α沉默, 可逆转TAE致缺氧引起的HIF-1α、VEGF和增殖核抗原升高, 控制血管新生和癌细胞增殖, 抑制残余癌生长, 加强TAE疗效. 且HIF-1α沉默, 可逆转放化疗耐受, 可作为一种辅助策略应用于肝癌的治疗, 有应用前景.

同行评价

本文结果可靠, 科学结论较明确, 实验证据较充足, 具有一定指导意义.

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备注

编辑: 田滢 电编:鲁亚静