肝细胞中HBV X基因的表达及其共培养的肝星状细胞的增殖和迁移

摘要

目的: 研究乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X, HBV X)基因在乙型肝炎病毒致肝纤维化中的作用.

方法: 构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP, 将其转染人肝细胞HL-7702后分成2组, 一组经G418筛选出稳定表达HBV X基因的肝细胞株(L02/x), 另一组予瞬时转染48 h(L02/48x). Real-time PCR、Western blot鉴定2组细胞HBV X基因的表达. 与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照, 将L02/x和L02/48x细胞分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)共培养36 h, 并检测各组HSCs增殖和迁移情况.

结果: Real-time PCR和Western blot实验显示, 转染pHBV-X-IRES2-EGFP载体的L02/x和L02/48x细胞均有HBV X基因的表达. 与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照, 与L02/x和L02/48x细胞共培养的HSCs的增殖和迁移均显著增多.

结论: HBV X基因在肝细胞中的表达可以促进HSCs发生增殖和迁移, 从而在乙型肝炎病毒致肝纤维化过程中起重要作用.

关键词: 乙型肝炎病毒X基因; 肝星状细胞; 共培养; 增殖; 迁移

Expression of the hepatitis B virus X gene in liver cells promotes the proliferation and migration of co-cultured hepatic stellate cells

Hong-Ying Chen, Xiao-Zhong Wang, Zhi-Xin Chen

Hong-Ying Chen, Xiao-Zhong Wang, Zhi-Xin Chen, Department of Gastroenterology, Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

Supported by: the Science and Technology Talent Foundation of Fujian, No. 2008F3043; and the Young Scholar Foundation of Health Department of Fujian, No. XH200801.

Correspondence to: Hong-Ying Chen, Associate Chief Physician, Department of Gastroenterology, Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China. zxl16@sina.com

Received: December 23, 2011
Revised: January 19, 2012
Accepted: February 27, 2012
Published online: March 28, 2012

Abstract

AIM: To determine whether the hepatitis B virus X (HBV X) gene is involved in the pathogenesis of hepatitis B-related cirrhosis.

METHODS: A eukaryotic expression vector containing the HBV X gene (pHBV-X-IRES2-EGFP) was constructed and transfected into HL-7702 cells. The transfected cells were divided into two groups. One group was selected with G418 and named L02/x, which could express the HBV X gene stably, and another group was transfected with pHBV-X-IRES2-EGFP for 48 h and named L02/48x. The expression of HBV X was detected by real-time PCR and Western blot. L02/x and L02/48x cells were then co-cultured with hepatic stellate cells (HSCs) for 36 h, and the proliferation and migration of HSCs were detected.

RESULTS: Real-time PCR and Western blot analyses showed that L02/x and L02/48x cells could express HBV X. Compared to HSCs co-cultured with HL-7702 cells transfected with empty vector and non-transfected cells, the proliferation and migration of HSCs co-cultured with L02/x or L02/48x cells significantly increased.

CONCLUSION: The expression of the HBV X gene in HL-7702 cells could promote the proliferation and migration of HSCs and may play an important role in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced liver fibrosis.

Key Words: Hepatitis B virus X gene; Hepatic stellate cells; Co-culture; Proliferation; Migration

0 引言

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可以导致慢性肝炎、肝纤维化和肝细胞癌的发生, 每年因乙型肝炎死亡者约为75万例. HBV基因组是一个不全双链的环状DNA分子, 其长链含有4个开放读码框架(open reading frame, ORF), 分别为编码前S1蛋白, 前S2蛋白及S蛋白的S基因, 编码前C蛋白与C蛋白的C基因, 编码DNA聚合酶蛋白的P基因, 以及编码X蛋白的X基因. X基因是HBV DNA中最小的一个ORF, 编码区位于1374-1818核苷酸之间, 其编码的HBx蛋白由154个氨基酸组成, 分子量为17 kDa. 已有大量的研究显示, HBx是一个多功能调节因子, 他可以通过调节转录、影响细胞增殖[1,2]与凋亡[3-6]、干扰细胞周期[7-9]及各种信号传导途径[10-15]、影响细胞修复[16-18]等从而在肝细胞癌发生发展中起重要的作用[19-22]. HBV是肝纤维化形成的重要因素之一, Liu等[23]研究发现HBV可以通过调节Ⅰ型胶原纤维增殖和表达而影响肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的增殖. Martín-Vílchez等[24]进一步研究证实HBx能激活HSCs而促进肝纤维化. 为进一步探讨HBV X基因在肝纤维化形成和发展中的作用, 本文通过构建HBV X基因真核表达载体, 使其在HL-7702人肝细胞中表达, 观察与肝细胞共培养的肝星状细胞增殖和迁移的情况, 揭示HBx与肝纤维化的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

用于获取目的基因HBV X的质粒pUCmT-x为本研究所保存, 真核荧光表达载体pIRES2-EGFP购自Clontech公司, 两者双酶切后连接构建表达HBV X基因的重组质粒pHBV-X-IRES2-EGFP. HL-7702肝细胞为本研究室保存, 质粒转染试剂盒lipo2000购自Invitrogen公司, 转染后经G418(购自sigma公司)筛选构建稳定表达X基因的肝细胞株. β-actin蛋白抗体(Mouse mAb to Beta-actin)购自abmart公司, HBV X蛋白抗体[Hepatitis B Virus X antigen antibody(X36C)]购自Abcam公司(ab2741), 经Realtime-PCR、Western blot进一步鉴定X基因的表达. 采用购自corning公司的Transwell非接触式共培养小室, 将购自中国科学院上海细胞库HSCs细胞与肝细胞共培养, 采用DMEM+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax培养基(培养基成分购自Gibco公司), 50 mL/LCO₂、950 mL/L湿润空气、37 ℃培养. 采用碧云天公司的CCK-8检测试剂盒、杰美公司的结晶紫试剂盒、Thermo酶标仪(MuLTiSKAN MK3)检测HSCs的增殖与迁移. 实验过程中所用的各种酶, 包括内切酶、连接酶、逆转录酶等购自上海生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 构建HBV X基因真核表达载体: 用PCR法从本研究所保存的pUCmT-x质粒[25]中扩增出HBV X基因片段, 在目的基因的5'端添加XhoⅠ酶切位点, 3'端添加EcoRⅠ酶切位点. 引物序列如下: 上游为5'-TAATctcgagATGGCTGCTAGGCTGTGCT-3'和下游5'-GTCAgaattcTTAATGGTG ATGGTGATGATGGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC-3'. PCR条件为94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 68 ℃延伸30 s, 共35个循环. 将目的基因PCR产物和目的载体pIRES2-EGFP用XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶分别进行酶切, T4 DNA连接酶连接上述酶切产物, 构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP. 经酶切及直接序列测定以确认重组质粒的成功构建.

1.2.2 HBV X基因转染肝细胞: 将肝细胞株HL-7702培养于含DMEM+10%FBS中. 选择对数生长期的肝细胞HL-7702, 采用脂质体转染的方法(按脂质体转染试剂盒lipo2000的说明书操作), 将质粒pHBV-X-IRES2-EGFP和pIRES2-EGFP分别导入肝细胞HL-7702中(6孔板每孔中加入2 μg DNA). 转染48 h后, 荧光显微镜观察细胞的转染效率. 一部分肝细胞转染48 h后经G418 800 mg/L选择培养2 wk后, 挑取单克隆予进一步扩增以构建稳定表达HBV X基因的肝细胞株并命名为L02/x, 转染空质粒组命名为L02/ctr. 另一部分肝细胞于重组质粒瞬时转染48 h后作为瞬时转染组直接进入共培养实验, 此细胞分别命名为L02/48x, 其相应的转染空质粒对照组命名为L02/48ctr.

1.2.3 Real-time PCR鉴定X基因的表达: (1)抽提5组细胞(L02/x、L02/48x、L02/ctr、L02/48ctr和HL-7702空白细胞)RNA并进行反转录, 检测RNA质量、浓度和纯度; (2)依据目的基因及内参基因ACTB(Beta Actin)设计并合成荧光定量PCR引物, 引物序列见表1. SYBR Green法荧光定量PCR分析各基因的表达, PCR条件为: 95 ℃ 2 min; (95 ℃ 20 s, 57 ℃ 15 s, 72 ℃ 20 s)×40 cycles, qPCR反应体系如下: 2X qPCR buffer mix 10 μL, Primer 1 μL, cDNA 1 μL, ddH₂O 8 μL; PCR结束后, 进行熔解曲线实验, 升温温度从60 ℃到95 ℃; (3)用△△Ct法进行各基因表达的相对定量.

表1 X基因qPCR检测引物序列.

引物名称	引物序列	产物(bp)
HBV X-F1	5'-CCCGTCTGTGCCTTCTCATC-3'	105
HBV X-R1	5'-ATCTCCTCCCCCAACTCCTC-3'
HBV X-F2	5'-CTAGGCTGTGCTGCCAACTG-3'	182
HBV X-R2	5'-AGAAGGCACAGACGGGGAGT-3'
hACTB-F	5'-TCCTTCCTGGGCATGGAGT-3'	208
hACTB-R	5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'

1.2.4 Western blot实验鉴定X基因的表达: 取稳定和瞬时转染X基因的肝细胞株L02/x和L02/48x, 其相应的转染空质粒细胞株L02/ctr和L02/48ctr, 以及相应的空白细胞对照组L02/NC和L02/48NC. Loading Buffer裂解此6组细胞并抽提蛋白, BSA法进行蛋白定量后行SDS-PAGE电泳, 恒压80 V, 30 min之后恒压120 V, 75-90 min, 恒压20 V条件下半干电转1 h, 将蛋白转移到PVDF膜上. 用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)室温封闭膜1 h; 用新配制的封闭液稀释一抗(HBV X蛋白抗体稀释比1:1 000; actin蛋白抗体稀释比1:4 000); 4 ℃, 一抗孵育过夜; 用PBST洗膜30 min后室温下二抗孵育膜1 h, 再次洗膜后ECL显影.

1.2.5 肝细胞与肝星状细胞共培养: 将上述6组肝细胞及HSCs培养于DMEM+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax培养液中. 采用Transwell共培养体系, 取HSCs悬液(细胞数约为6×10⁵)接种到PBS浸润的上层小室中; 用镊子将小室仔细放于培养肝细胞的孔板中, 避免底部产生气泡, 放回培养箱中于50 mL/LCO₂、950 mL/L湿润空气、37 ℃培养. 共培养36 h后进行下述实验.

1.2.6 CCK-8检测HSCs增殖: 在共培养36 h后, 每孔加入10 μL CCK-8, 混匀后培养箱中孵育3 h, 测定450 nm处的吸光度(A)值. 酶标仪读取待测样品和空白对照在450 nm处的A值, 将各待测样本的A值记为测量值, 空白对照的A值记为空白值, 则终值 = 测量值-空白值.

1.2.7 检测HSCs的迁移: 共培养36 h后取出小室, 去除小室中的培养基, 用湿润的棉签仔细擦掉小室上层的细胞; 在室温下, 用PBS润洗小室上表层, 将小室转移到新的6孔板中, 用4%的多聚甲醛室温固定细胞15 min, 用结晶紫染色试剂盒对细胞进行染色(按试剂盒说明书进行操作), 后用酶标仪检测570 nm处的A值, 然后计算细胞迁移.

统计学处理 重复上述实验3次, 将终值绘制柱状图, 结果用mean±SD表示, 用SPSS17软件进行单因素方差分析, 以P<0.05为有统计学差异.

2 结果

2.1 重组克隆的成功构建

重组克隆的酶切鉴定如图1所示, pHBV-X -IRES2-EGFP重组载体经酶切电泳后可见HBV X基因目的条带(约470 bp). NCBI网上比对测序序列, 显示与HBV X基因99%相似度, 结果证明已成功构建HBV X重组质粒(图2).

图1 pHBV-X -IRES2-EGFP重组载体酶切鉴定. 1: HBV X重组质粒; 2: BamH1酶对重组载体质粒进行酶切; 3: 5 000 bp Marker.

图2 重组克隆pHBV-X-IRES2-EGFP的测序.

2.2 PCR检测各个细胞株中目的基因的mRNA表达

重组质粒、L02/x、L02/48x和空白对照组HL-7702细胞均有内参基因的表达, 前3组亦可见HBV X mRNA表达, 而空白对照组HL-7702细胞则未见目的基因表达, 即稳定和瞬时HBV X基因的肝细胞中有HBV X mRNA表达(图3). △△Ct法对各组目的基因表达相对定量, 结果显示在稳定转染株中, L02/x的HBV X mRNA表达量为对照组L02/ctr的4倍, L02/48x的HBV X mRNA表达量为其对照 L02/48ctr的54 855倍, 进一步证实稳定和瞬时HBV X基因的肝细胞中有HBV X mRNA表达(表2, 图4, 图5).

表2 各组细胞HBV X基因的Real-time PCR检测.

样品	基因Actin				基因HBV X				ΔCt	-ΔΔCt	2-ΔΔCt
	Ct1	Ct2	Ct3	Ct-Ave	Ct1	Ct2	Ct3	Ct-Ave
L02/48x	23.71	23.58	23.53	23.61	13.18	13.37	13.60	13.38	-10.22	-15.74	54854.92
L02/48ctr	21.79	21.81	21.73	21.78	27.02	27.62	27.25	27.30	5.52	0	1
L02/x	17.04	16.80	17.15	17.00	29.05	28.89	28.54	28.80	11.83	-2.01	4.03
L02/ctr	16.97	16.74	16.70	16.80	30.86	30.51	30.43	30.60	13.84	0.00	1.00

图3 RT-PCR检测各个细胞株中目的基因的表达. 1, 6: 2 000 bp Marker; 2-5: 内参引物hACTB在质粒、L02/48x、HL-7702和L02/x中的扩增; 7-10: X基因引物在质粒、L02/48x、HL-7702和L02/x中的扩增.

图4 各组细胞目的基因及内参基因的qPCR扩增曲线. A: 目的基因扩增曲线; B: 内参基因扩增曲线.

图5 各组细胞目的基因及内参基因的qPCR溶解曲线. A: 目的基因在各组细胞cDNA中的溶解曲线; B: 内参基因hACTB在各组细胞cDNA中的溶解曲线.

2.3 Western blot检测各个细胞株中目的基因的蛋白表达

稳定和瞬时转染HBV X基因的肝细胞, 即L02/x和L02/48x, 均可见HBV X蛋白(17 kDa)的表达, 而转染空质粒组L02/ctr和L02/48ctr, 以及相应的空白细胞对照组L02/NC和L02/48NC均未有该蛋白的表达, 即成功构建了稳定表达X基因的肝细胞株, 同时验证了瞬时转染X基因的肝细胞确有目的基因的表达(图6).

图6 各组细胞中蛋白的Western blot检测. 1-3: 稳定转染组L02/NC、L02/ctr、L02/x; 4-6: 瞬时转染组L02/48x、L02/48ctr、L02/48NC.

2.4 CCK-8检测HSCs细胞增殖

运用SPSS17软件进行统计分析, 结果显示与稳定和瞬时HBV X基因的肝细胞共培养的HSCs增殖数值显著高于相应的转染空质粒组和空白组, 差别有显著意义(表3, 图7, P<0.05).

表3 CCK-8检测各组共培养HSCs细胞增殖情况.

	第1次	第2次	第3次	mean±SD
L02/48x	0.763	0.758	0.764	0.7617±0.0032
L02/48ctr	0.487	0.470	0.508	0.4883±0.0190
L02/48NC	0.497	0.503	0.492	0.4973±0.0055
L02/x	0.753	0.735	0.725	0.7377±0.0142
L02/ctr	0.496	0.506	0.489	0.4970±0.0085
L02/NC	0.486	0.512	0.476	0.4913±0.0186

图7 CCK8检测各组HSCs细胞增殖情况.

2.5 检测及计算HSCs的迁移

结晶紫染色后, 运用SPSS17软件进行统计分析, 结果显示与稳定和瞬时HBV X基因的肝细胞共培养的HSCs迁移数值显著高于相应的转染空质粒组和空白组, 差别有显著意义(表4, 图8, P<0.05).

表4 各组共培养HSCs细胞迁移情况.

	第1次	第2次	第3次	mean±SD
L02/48x	0.424	0.427	0.448	0.4330±0.0131
L02/48ctr	0.244	0.259	0.272	0.2583±0.0140
L02/48NC	0.279	0.235	0.297	0.2703±0.0319
L02/x	0.439	0.389	0.395	0.4077±0.0273
L02/ctr	0.256	0.247	0.278	0.2603±0.0159
L02/NC	0.246	0.247	0.257	0.2500±0.0061

图8 各组HSCs细胞迁移情况.

3 讨论

我国属于HBV感染的高发病区, 每年有11-13万人死于HBV感染所致的肝硬化和肝细胞癌. 1989年Shirakata等[26]将HBV X基因转染小鼠成纤维细胞, 并将其移植裸鼠发现该基因可诱发肿瘤形成, 从而揭示了HBV X基因的致癌作用. 近30年来, 大量的分子生物学及动物实验已证实HBx蛋白可以通过影响PI-3激酶、p38和JNK等信号通路[5,27]、干扰细胞修复[17,18]等机制使细胞的增殖和凋亡失衡而致肝细胞癌的发生. 然而HBV X基因与肝纤维化的相关研究却少有报道, 二者关系未完全明确.

目前认为HSCs活化是肝纤维化发生、发展的关键环节, 各种致纤维化因子激活HSCs[28], 使其活化、增殖, 转化为肌成纤维细胞样细胞, 合成多种细胞因子、大量合成细胞外基质, 尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原等, 并获得细胞运动和收缩功能, 向损伤部位迁移聚集, 直接参与损伤修复, 加速胶原沉积, 促进纤维化进程[29]. 近年来仅有少数研究报道HBx有可能通过各种细胞因子旁分泌激活HSCs并促进其增殖, 从而参与肝纤维化进程[30]. 为进一步明确HBV X基因与肝纤维化的关系, 本实验通过构建X基因真核表达载体, 以此为平台构建稳定和瞬时转染该基因的HL-7702肝细胞, 检测与其共培养的HSCs的增殖与迁移情况, 最后统计学分析HBV X基因对HSCs增殖和迁移的影响, 从而确立HBV X基因在肝纤维化中的作用.

在实验中, 我们首先构建了HBV X基因的荧光真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP, 经酶切及直接测序证实重组载体的成功构建. 其次是肝细胞的选择, 目前国内外大多数肝细胞研究选用HepG2为实验细胞, 但是此细胞具有部分肝癌细胞的特性, 不宜用于HBV致肝纤维化的研究. 为了更好模拟体内环境, 本实验选用具有正常肝细胞特性的HL-7702肝细胞, 通过脂质体转染技术, 获得稳定和瞬时转染HBV X基因的肝细胞, PCR和蛋白印迹实验均证实两组细胞中X基因的mRNA和蛋白的表达. 最后是肝细胞与HSCs的共培养实验. 既往研究已发现瞬时转染X基因24 h即有表达, 并逐渐上升, 于72 h达到最高峰, 之后回落[9]. 以此为依据, 本实验选取瞬时转染48 h和稳定转染的肝细胞与HSCs于Transwell非接触培养体系中共培养36 h, 之后检测HSCs的增殖与迁移情况, 结果显示, 与转染空质粒和未转染肝细胞共培养的HSCs做对照, 与转染X基因组共培养的HSCs的增殖和迁移数值显著升高(P<0.05).

实验结果说明HBV X基因在肝细胞中的表达可促进与其共培养的HSCs发生增殖与迁移. 如上所述, HSCs的活化与增殖是肝纤维化进程的一重要环节, HBx对HSCs的这一作用揭示了其在肝纤维化发生与发展中的作用, 即HBV X基因的表达能促使HSCs增殖和迁移, 从而促进肝纤维化进程.

志谢

感谢唐南洪、李秀金及王晓茜同志在本试验中给予的大力帮助.

评论

背景资料

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可以导致慢性肝炎、肝纤维化和肝细胞癌的发生, 每年因乙型肝炎死亡者约为75万例.

同行评议者

杨江华, 副教授, 皖南医学院弋矶山医院感染科

研发前沿

目前认为HSCs活化是肝纤维化发生、发展的关键环节, 各种致纤维化因子激活HSCs, 使其活化、增殖, 转化为肌成纤维细胞样细胞, 合成多种细胞因子、大量合成细胞外基质, 直接参与损伤修复, 加速胶原沉积, 促进纤维化进程.

相关报道

研究显示, HBx是一个多功能调节因子, 他可以通过调节转录影响细胞增殖与凋亡, 干扰细胞周期及各种信号传导途径, 影响细胞修复等, 从而在肝细胞癌发生发展中起重要的作用.

同行评价

本文有一定的科学性、创新性和可读性, 为HBV X基因与肝纤维化的临床研究提供了较为可靠的参考依据.

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备注

编辑: 张珊珊 电编: 闫晋利