RASSF1A基因启动子区甲基化在胃癌组织中的检测

摘要

目的: 检测胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状况, 并探讨其与临床病理特征的关系.

方法: 采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR, MSP)检测39例胃癌组织, 及相应癌旁组织和30例对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化水平.

结果: 胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化率显著高于癌旁组织甲基化率及对照组(64.1% vs 7.7%, 0%, 均P<0.01). 胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度及淋巴结转移与否的RASSF1A基因甲基化率的差异均无统计学意义.

结论: RASSF1A基因启动子区甲基化与胃癌的发生密切相关, MSP法是一种快速、敏感的基因甲基化检测方法, 可用于胃癌的辅助诊断.

关键词: 胃癌; RASSF1A基因; 甲基化; 甲基化特异性聚合酶链反应

Detection of RASSF1A promoter methylation in gastric cancer

Pei Liu, Xiang-Jun Jiang, Yin-Lin Ge

Pei Liu, Xiang-Jun Jiang, Department of Gastroenterology, Qingdao Municipal Hospital, Affiliated to Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong Province, China

Yin-Lin Ge, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, Shandong Province, China

Correspondence to: Xiang-Jun Jiang, Department of Gastroenterology, Qingdao Municipal Hospital, Affiliated to Qingdao University, 1 Jiaozhou Road, Qingdao 266011, Shandong Province, China drjxj@163.com

Received: August 14, 2009
Revised: October 9, 2009
Accepted: October 12, 2009
Published online: October 28, 2009

Abstract

AIM: To detect RAS association domain family protein 1A (RASSF1A) promoter methylation and analyze its correlation with clinical and pathological parameters in gastric cancer.

METHODS: Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) was used to detect RASSF1A promoter methylation in tumor and tumor-adjacent tissues from 39 gastric cancer patients and in 30 control specimens from superficial gastritis patients or healthy volunteers.

RESULTS: The rate of RASSF1A promoter methylation was significantly higher in gastric cancer than in tumor-adjacent tissues and control specimens (64.1% vs 7.7% and 0%, respectively; both P < 0.01). No correlation was found between RASSF1A promoter methylation and age, gender, tumor differentiation or lymph node metastasis in patients with gastric cancer.

CONCLUSION: RASSF1A promoter methylation is closely associated with the oncogenesis of gastric cancer. MSP is a novel and specific method for detection of promoter region methylation and can be used to diagnose gastric carcinoma.

Key Words: Stomach neoplasm; RASSF1A gene; Methylation; Methylation-specific PCR

0 引言

近年越来越多的研究显示, 抑癌基因启动子区高甲基化导致其转录抑制、表达缺失, 而且在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象, 为肿瘤的早期诊断提供了新的思路[1]. Ras相关区域家族1A(ras-association domain family 1A, RASSF1A)基因是近年发现的新型抑癌基因. 研究提示, 该基因启动子区高甲基化造成的失活在多种肿瘤中很常见[2]. 我们采用MSP检测胃癌组织、相应癌旁组织及对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化水平, 探索RASSF1A 基因启动子区甲基化与胃癌发生、发展的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

所有标本取自2008-12/2009-05青岛市市立医院, 其中39例胃癌及相应癌旁组织取自普外科手术切除标本(癌旁组织取自距癌边缘5 cm), 30例对照组织(其中慢性浅表性胃炎组织18例及正常胃黏膜组织12例)取自门诊胃镜室. 所有标本自取材后立即放入液氮中, 后转入-70℃冰箱保存. 癌组织, 癌旁组织和胃镜活检组织都经病理检查, 并确认手术标本切缘为阴性.

1.2 方法

1.2.1 DNA提取: 酚/氯仿法提取DNA, 测A260/A280比值为1.8-2.0, 存于-20℃冰箱保存备用.

1.2.2 DNA修饰: 采用Zymo Research公司EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(D5005), 按说明书步骤进行操作.

1.2.3 引物设计: 根据RASSF1A基因组DNA启动子区CpG岛DNA序列设计甲基化特异性PCR引物, RASSF1A甲基化(M)和非甲基化(U)引物(表1)由TaKaRa宝生物公司合成.

表1 MSP引物序列及产物片段.

基因	正义	反义	长度(bp)
RASSF1A(M)	GGGTTTTGCGAGAGCGCG	AACAAACGCGAACCGAACG	166
RASSF1A(U)	GGGGTTTTGTGAGAGTGTG	ACTAACAAACACAAACCAAACA	170

1.2.4 MSP: PCR反应体积25 µL, 其中Perfectshot^TM Taq(loading dye mix)(TaKaRa宝生物公司)12.5 µL, 引物各0.5 µL, 修饰后的DNA 2 µL, 余下的以灭菌双蒸水补齐至25 µL. 反应条件: 95℃预变性15 min, 94℃变性30 s, 64℃(甲基化)/59℃(非甲基化)退火50 s, 72℃延伸30 s, 40个循环后, 72℃延伸10 min.

1.2.5 对照设置: 以灭菌双蒸水代替DNA作为空白对照; 以健康志愿者血清DNA作为正常对照; 健康志愿者外周血淋巴细胞DNA经CpG甲基化转移酶M.SssI(New England Biolabs)处理后作为甲基化对照, 以未行甲基化处理的健康志愿者外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化对照.

1.2.6 电泳: 取6 µL扩增产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳. 用UIV凝胶电泳成像及图像分析系统进行拍照和图像分析.

统计学处理 应用SPSS13.0统计软件, 组间比较采用卡方检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化

胃癌组、癌旁组及对照组RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化率分别为64.1%(25/39)、7.7%(3/39)和0.0%(0/30). 胃癌组的甲基化率显著高于癌旁组和对照组(均P<0.01). 其中有2例胃癌组织同时发生甲基化与非甲基化. 3例发生甲基化的癌旁组织所对应的胃癌组织均发生了甲基化(图1).

图1 MSP反应产物琼脂糖电泳结果. MP: 甲基化对照; UP: 非甲基化对照; H2O: 灭菌双蒸水代替DNA电泳结果作为空白对照; M: 甲基化; U: 非甲基化; T1、T2、T3、T4: 胃癌组织; N1、N2、N3: 癌旁组织; T4同时出现甲基化与非甲基化.

2.2 RASSF1A基因启动子区CpG岛高甲基化与胃癌临床病理特征的关系

胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度的RASSF1A基因甲基化率差异均无统计学意义. 有淋巴结转移组甲基化率(73.9%)较无淋巴结转移组甲基化率(50.0%)高, 但差别无统计学意义. 进展期胃癌和早期胃癌组织中RASSF1A基因甲基化率分别为66.7%和33.3%, 2组比较无明显差异(表2).

表2 胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化与临床病理特征的关系 n(%).

临床病理特征	RASSF1A基因		P值
	甲基化	非甲基化
性别			0.478
男	19(67.9)	9(32.1)
女	6(54.5)	5(45.5)
年龄(岁)			0.225
>50	22(68.8)	10(31.2)
≤50	3(42.9)	4(57.1)
分期			0.289
Ⅰ-Ⅱ期	1(33.3)	2(66.7)
Ⅲ-Ⅳ期	24(66.7)	12(33.3)
淋巴结转移			0.179
有	17(73.9)	6(26.1)
无	8(50.0)	8(50.0)
分化程度			0.326
低	16(72.7)	6(27.3)
中	8(57.1)	6(42.9)
高	1(33.3)	2(66.7)

3 讨论

DNA甲基化是具有可逆性与遗传性的一种表观遗传学修饰方式[3], 由S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体, 在DNA甲基转移酶的催化下, CpG二核苷酸的胞嘧啶环5'位置的氢被活性甲基所取代, 从而转变成5-甲基胞嘧啶. 基因启动子区若发生甲基化, 可致基因转录沉寂, 表达受抑制. 研究证实DNA甲基化机制是抑癌基因失活的一个重要途径, 与肿瘤发生密切相关.

2000年Dammann et al[4]从3号染色体短臂(3p21.3)上克隆出RASSF1基因, 由于选择性剪接和启动子的不同存在不同的转录本, 其中最普遍且最重要的是转录本A(RASSF1A). RASSF1A作为一种抑癌基因, 通过多种途径抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老, 其功能失活导致对肿瘤的抑制作用丧失. RASSF1A在正常组织中100%表达, 而在多种恶性肿瘤中表达明显降低或缺失, 现已明确主要机制是由于其启动子区CpG岛高甲基化[2].

甲基化特异性PCR法是一种敏感度高, 特异性强, 快速的基因甲基化检测方法. 本研究显示对照组中无1例RASSF1A基因启动子区发生甲基化, 胃癌组中该基因启动子区甲基化率(64.1%)显著高于癌旁组(7.7%)(P<0.01). Kang et al研究发现RASSF1A甲基化现象在胃癌中频繁出现, 而在其他病变(如胃腺瘤、肠上皮化生及慢性胃炎等)中出现很少[5-6]. 结合文献及本研究结果, 提示RASSF1A基因启动子区甲基化是胃癌频发的分子事件, 可能是胃癌早期发展中的一个步骤. 本研究中3例癌旁组织中RASSF1A基因发生了甲基化, 因标本来自胃癌患者, 虽经病理证实为非癌组织, 分子水平上可能并非正常, 因为表观遗传学改变的出现一般早于肿瘤的发生.

从本研究临床病理特征分析发现, 胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度的RASSF1A基因启动子区甲基化率的差异均无统计学意义. 有淋巴结转移组甲基化率(73.9%)较无淋巴结转移组(50.0%)高, 但2组间比较也无明显差异性. 上述结果与文献研究结果一致[7]. 另分析发现进展期胃癌和早期胃癌组织中RASSF1A基因甲基化率分别为66.7%和33.3%, 两者比较无明显差异性, 而Byun et al[8]研究显示该基因缺失或异常低表达与肿瘤的分期和分级有关, 结果不一致, 可能与本研究中早期胃癌例数少有关, 需进一步探讨.

本研究显示, RASSF1A基因启动子区高甲基化与胃癌的发生密切相关, 可能是胃癌早期发展中的一个分子事件. 将RASSF1A启动子区高甲基化作为标志物, 结合其他几种甲基化率高的基因, 用甲基化特异性PCR法进行联合检测, 可为胃癌的早期诊断提供重要的理论依据和方法. 另发现, 不表达RASSF1A的肿瘤细胞株经甲基化抑制剂5-氮-2脱氧胞苷(5-aza-dC)处理后, 该基因表达恢复[9], 故抑制和逆转抑癌基因甲基化为防治肿瘤提供了新的思路, 需进一步研究.

评论

背景资料

RASSF1A是多种人类肿瘤中失活的一种抑癌基因, 研究发现其失活的主要机制是该基因启动子区的甲基化.

同行评议者

高泽立, 主任医师, 上海交通大学医学院附属第九人民医院周浦分院消化科

创新盘点

本文用甲基化特异性PCR方法检测胃癌及癌旁组织和正常对照组织中RASSF1A基因启动子区甲基化发生率, 并分析其与肿瘤临床病理特征的关系, 为胃癌的早期诊断提供方法和依据.

应用要点

本研究显示, RASSF1A基因启动子区高甲基化可能是胃癌早期发展中的一个分子事件. 将RASSF1A启动子区高甲基化作为标志物, 结合其他几种甲基化率高的基因, 用甲基化特异性PCR法进行联合检测, 可为胃癌的早期诊断提供重要的理论依据和方法.

同行评价

本文选题新颖, 紧密联系当前研究热点, 为临床早期诊断胃癌及治疗提供了新的思路, 可读性较好.

备注

编辑: 李军亮 电编:何基才

参考文献

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