幽门螺杆菌培养及抗原蛋白的分离纯化

摘要

幽门螺杆菌(H. pylori)是一种生存于人胃中的弯曲状菌, 能导致人的慢性胃炎, 消化性溃疡和胃癌, 其治疗多用抗生素治疗, 但其副作用较大. 给奶牛免疫H. pylori疫苗后, 其分泌的牛奶中含抗H. pylori的免疫球蛋白, 能够预防和治疗人类H. pylori感染, 且没副作用. 在生产免疫乳时, H. pylori疫苗制备是基础性工作, 并且在亚单位疫苗中, 抗原蛋白的制备和分离纯化又最为关键. 本文就H. pylori的培养(固体和液体培养)和抗原蛋白(尿素酶、空泡毒素、毒素相关蛋白和脂多糖)的理化性质、重组表达以及分离纯化方法进行比较研究.

关键词: 幽门螺杆菌; 培养; 尿素酶; 空泡毒素; 毒素相关蛋白; 脂多糖

Culture of Helicobacter pylori and purification of antigen protein

Sheng-Guo Zhao, Jia-Qi Wang, Guang-Lei Liu, Jin-Bo Cheng, Chun-Gang Zhang

Sheng-Guo Zhao, Jia-Qi Wang, Guang-Lei Liu, Jin-Bo Cheng, Chun-Gang Zhang, State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100094, China

Supported by: the Dairy Momentous Project of National Key Technology R&D Program during the 11th Five-Year Plan Period, No. 2006BAD04A03.

Correspondence to: Jia-Qi Wang, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, 2 Yuanmingyuan Western Road, Beijing 100094, China. wang-jia-qi@263.net

Received: September 13, 2007
Revised: February 27, 2008
Accepted: March 28, 2008
Published online: April 8, 2008

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) live in the stomach of human. It is a kind of curve bacteria which can lead to chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. Usually, antibiotics are used to treat the patients, but they have a lot of side effects. Milk of milch cow immunized with H. pylori vaccine can prevent and treat the infection of H. pylori without side effects. During the production of immune milk, the basic work is to prepare vaccine. During the preparation of sub-unit vaccine, key is to isolate and purify the antigen protein. In this article, we discuss the culture of H. pylori (solid and liquid culture), the recombinant expression and purification of its antigen protein (urease, VacA, CagA and lipopolysaccharide).

Key Words: Helicobacter pylori; Culture; Urease; Vacuolization cytotoxin A; Cytotoxin associated antigen A; Lipopolysaccharides

0 引言

幽门螺杆菌(H. pylori)是1983年从澳大利亚患者炎性胃角上皮细胞分离出来, 现已证实在全世界人群中的感染率达50%以上, 而在我国人群中感染率则高达58.07%[1-2]. 感染H. pylori后, 能引起慢性胃炎和消化性溃疡, 还易转变成胃癌和胃MALT淋巴瘤[3-5]. 目前主要使用抗生素进行治疗, 但抗生素治疗存在一定的不良反应, 且产生耐药性. 给奶牛免疫H. pylori疫苗后, 其分泌的牛奶中含抗H. pylori的免疫球蛋白, 能够预防和治疗H. pylori感染[6-9]. 在此项技术中, H. pylori疫苗的制备是首当其冲的工作. H. pylori全菌疫苗抗原成分复杂, 制备疫苗存在很多困难[10-11]. 而亚单位疫苗逐渐引起人们的重视, 单一H. pylori抗原的免疫保护率几乎低于80%, 2种以上抗原组合可获得理想的保护效果, 显示了多价疫苗将成为今后H. pylori疫苗研究的主要方向[12-13]. 因此, 菌体抗原蛋白的制备和分离纯化显得尤为重要. 现就H. pylori培养和尿素酶(Urease)、空泡毒素A(vacuolization cytotoxin A, VacA)、毒素相关蛋白A(cytotoxin associated antigen A, CagA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的重组表达和分离纯化研究进展进行阐述, 为下一步免疫乳牛和生产免疫乳奠定基础.

1 H. pylori的分离培养

H. pylori是一种S型、弧形或弯曲形的革兰氏阴性细菌, 生化反应中尿素酶阳性, 过氧化氢酶阳性, 氧化酶阳性、马尿酸钠阴性. H. pylori对营养要求较高, 在微需氧、适度温度、37℃环境下缓慢生长, 一般需要3-7 d的时间才能形成针尖样半透明的小菌落[14-18](表1).

表1 幽门螺杆菌培养基的选择.

菌种	基础培养基	抗生素	添加物	培养结果	参考文献
ATTC43504	脑心浸液(BHI)	萘啶酸(10 g/L, 万古霉素(6 g/L), 两性霉素B(2 g/L), 多黏菌素B(16 g/L)	50 g/L改良的巧克力琼脂(新鲜羊血∶热羊血 = 2∶1), 10 g/L Isovitalex	分离率: 92.6%	Ding et al[14], 2001
12476(恒河猴)	布氏肉汤琼脂(固)	万古霉素(3 mg/L), 甲氧卞二氨嘧啶(5 mg/L), 两性霉素B(2 mg/L)	脱纤维蛋白马血(50 mL/L), IsoVitaleX(10 mL/L), 氯血红细胞素(1 g/L)	7×1013 CFU/L	Kitsos et al[15], 1998
12476(恒河猴)	布氏肉汤琼脂(液)	万古霉素(3 mg/L), 甲氧卞二氨嘧啶(5 mg/L), 两性霉素B(2 mg/L)	脱纤维蛋白马血(50 mL/L), IsoVitaleX(10 mL/L),氯血红细胞素(1 g/L)	6.8×1013 CFU/L	Kitsos et al[15], 1998
CCUG17874	布氏肉汤(液)	头孢磺啶(6 mg/L), 万古霉素 (5 mg/L), 甲氧苄氨嘧啶(10 mg/L), 两性霉素B(8 mg/L)	(2, 6-di-O-methyl)-βCD(2 g/L)	1.85 A580nm	Marchini et al[16],1995
ATCC49503	脑心浸液琼脂(BHI)	100 mL含TMP 50 mg, 古霉素60 mg, 多黏霉素B 2500 IU,两性霉素20 mg	2, 6-di-O-methyl-β-cyclodextrin	无	Ohno et al[17], 2007
NCTC11637	哥伦比亚琼脂(CAB)	40 mL中含万古霉素(16 mg), 两性霉素B(16 mg), 多黏菌素B(0.6 mg), 三甲氧卞二胺嘧啶(8 mg)	脱纤维绵羊血	4.0×1011 CFU/L	谢献胜 et al[18], 2006

在制备抗原疫苗时, 需要对细菌进行大量规模化培养, 常规的固体平板培养无法满足菌量需求. 所以, 用液体培养基培养细菌已越来越多的用于疫苗生产中. 但是含血清的菌液, 抗原的纯化特别困难, 多次洗涤细菌, 可能导致细菌表面蛋白的大量损失, 并且成本高[15,19-20]. 实验表明, 在用添加有环糊素的液体培养基发酵细菌时, 也能得到与添加血清一样的效果. 因此, 在用液体培养基培养H. pylori时, 常选用国际标准菌株, 在基础培养基中添加复合抗生素, 以抑制其他细菌生长, 并向基础培养基中添加营养性添加剂, 如环糊精, 经过37℃, 振荡箱中培养几天后, 便可以得到理想的菌体产量.

2 H. pylori的主要抗原蛋白

2.1 Urease

M_r = 380 000±30 000, 等电点5.99±0.03, 最适pH8.2, Km值0.3±0.1 mmol/L. H. pylori Urease单体由A、B两个亚单位组成, 呈六聚体, M_r分别为62 000±2000和30 000±1000[21-22]. Urease被认为是最有代表性的毒素, 占细菌可溶性蛋白的6%, 其水解产生的氨能够中和胃酸, 保护细菌本身免受伤害. 同时尿素的水解产物氢氧化铵可以明显的造成组织损害, 细菌过度生长促使硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而产生致癌作用.

2.2 VacA

在中性环境中是无活性的, 必须在酸性环境下解离成Mr为90 000的单体, 才具活性. H. pylori首先编码产生Mr约140 000的VacA前体蛋白, 经降解信号序列(s)及跨膜输出段后产生M_r为95 000的分泌性活性毒素VacA, 他是一种AB型毒素, 进一步降解产生M_r为37 000的A亚单位与58 000的B亚单位[26-27]. VacA型H. pylori菌株能导致正常细胞空泡样变、细胞凋亡、细胞骨架重排等形态学改变, 与消化性溃疡, 胃癌等密切相关[28-30].

2.3 CagA

是一种具有强免疫原性的亲水性外膜蛋白, 不同菌株CagA的M_r范围是128 000-140 000. CagA蛋白的等电点为9.72, 是疏水性蛋白, 无前导肽及跨膜区[31-32]. CagA与VacA在临床上密切相关, CagA对于VacA的转录后折叠、胞外运输、甚至毒素正常功能都必不可少. CagA的存在更适于H. pylori定居在胃黏膜上, CagA能提高黏膜炎症反应程度. CagA阳性的H. pylori能够引起更严重而长期的胃黏膜炎症反应, 而长期的慢性炎症易导致胃黏膜萎缩, 并发展成为慢性萎缩性胃炎, 甚至胃癌[33-34].

2.4 LPS

是革兰氏阴性菌胞膜的主要组成成分, H. pylori LPS由内核和脂质A组成, 多糖成分主要含有半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖等[36-37]. H. pylori与沙门氏菌和大肠杆菌相比, 其LPS免疫活性更低, 因为小鼠的半数致死量, H. pylori LPS要高出大肠与沙门菌LPS的500-10 000倍. H. pylori LPS能加速组织胺的释放和DNA合成, 还能增加胃黏膜细胞的超氧阴离子, 引起胃黏膜细胞凋亡[38-39].

3 抗原蛋白的制备及分离纯化

3.1 抗原蛋白的制备

H. pylori中的抗原蛋白的制备, 一种方法是, 通过固体或液体培养基大量培养H. pylori后, 直接从菌液中进行提取, 这种方法操作比较简单, 耗时少, 容易掌握. 但是H. pylori培养比较困难, 尤其是液体培养, 且抗原蛋白中含有很多的杂蛋白, 在蛋白提纯时比较费时费力, 同时需应用佐剂才能诱导有效的免疫反应, 而佐剂大多数对机体有不同程度的毒性作用, 因此用基因工程方法, 对抗原蛋白基因进行重组表达制备疫苗, 成为一种切实有益的途径[21-30,40]. 抗原蛋白的重组表达程序: 先从H. pylori菌体中提取基因, 再利用设计好的相应抗原蛋白的基因引物, 进行PCR扩增, 得到大量的抗原蛋白基因片段, 再将这些片段通过双酶切和连接酶作用结合到质粒载体上, 得到重组载体. 通过转化作用将其转移到细菌内, 根据重组载体的标志作筛选, 挑取单斑, 抽提质粒后双酶切鉴定. 以阳性质粒转化表达宿主菌的感受态细胞, 接种LA(B)培养基, 用IPTG进行诱导表达, 便可得到大量高纯度抗原蛋白[13,41-42]. H. pylori重组表达时, 同样的载体、同样的系统, 很可能表达这个蛋白表达量奇高, 但是另外一个就是做不出来, 所以没有万能的载体, 只有永恒的分析. 我们用大肠杆菌做受体菌, 是由于其易于生长和控制; 培养成本低; 可供选择质粒丰富, 但是也会形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性. 常用的抗原蛋白重组表达方式见表2.

表2 H pylori抗原蛋白的重组表达.

抗原蛋白	基因提取	重组载体	转化细菌	诱导表达	结果	参考文献
Urease	酚/氯仿抽提	pHP802	E.coli HB101, DH5a	IPTG诱导表达, LA液体培养基	Western blot证实获得UreB重组蛋白扩增出的ure基因和基因库中的相同, Western blot检测到特异性蛋白条带	Hu et al[45], 1992
Urease	CTAB法抽提	pIRES	减毒沙门氏菌LB5000	IPTG诱导表达, LB培养液		徐灿 et al[46]2005
Urease	基因组抽提试剂盒	pET28	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	PCR扩增出414 bp的目的片段, 免疫印迹表明、重组蛋白能够被特异性血清识别	袁小澎 et al[47]2007
VacA	酚/氯仿抽提	pMM592	E.coli ER2566	IPTG诱导表达, TBKAN培养液	免疫印迹分析, 能与H pylori(+)患者血清发生结合, ELASA检验重组蛋白有良好的抗原性	McClain et al[48], 2003
VacA	酚/氯仿抽提	pQE31	E.coli M15	IPTG诱导表达, LA培养液	SDS-PAGE显示表达产物Mr为37 000和58 000	杨贵珍 et al[49], 2006
VacA	碱裂解法	pET32a	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	ELASA检验重组蛋白有良好的抗原性	段秀杰 et al[50], 2006
CagA	基因组提取	pMD18-T, 试剂盒	E.coli TOP10 pGEX-4T-1	IPTG诱导表达, LB培养液	SDS-PAGE显示表达产物Mr为37 000和60 000, 免疫印迹分析, 能与H. pylori(+)患者血清发生结合	宁云山 et al[51],2006
CagA	基因组提取 试剂盒	pMG36e	L. lactis	IPTG诱导表达	DNA序列分析表明重组基因与原基因有97.4%的一致性, Western bolt 2006证实了重组蛋白的存在及强的免疫原性	Kim et al[52], 2006
CagA	基因组提取 试剂盒	pET42a	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	该抗原检测抗体的敏感性为92.9%	张静 et al[53], 2005

3.2 抗原蛋白的分离纯化

H. pylori抗原蛋白的分离纯化, 是利用不同蛋白间内在的相似性与差异性, 利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染, 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来. 蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段. 粗分离阶段主要将H. pylori抗原蛋白和H. pylori细胞成分如DNA、RNA等分开. 一般是将H. pylori菌液离心, 用缓冲液或水重悬, 硫酸铵盐析, 再用透析袋透析. 此方法操作简单, 但同时分离得到的抗原蛋白纯度特别低, 里面含有大量的杂蛋白, 在对机体进行免疫时, 会产生交叉反应[43-45]. H. pylori抗原蛋白精细纯化阶段则需要更高的分辨率, 此阶段是把H. pylori目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来. 目前, 人们多用层析技术对H. pylori抗原蛋白进行精细纯化, 其包括凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析等[21-26]. 凝胶过滤层析纯化的蛋白范围太宽, 而且只对球形的蛋白比较适合, 常用于第一步纯化; 离子交换层析过程中有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果, 但仅此一步还是得不到纯的蛋白; 疏水作用层析由于在高盐浓度下上样, 所以更适合于离子交换层析的下一步; 亲和层析成本比较高, 单抗结合力太强也易被酶破坏, 但是纯化的浓缩率特别高, 适于纯化过程后期使用[27-32]. 所以, 在对H. pylori抗原蛋白样品进行层析时, 要首先明白各抗原蛋白的等电点, M_r大小, 组合形式等. 根据蛋白的性质选择合适的层析柱, 并合理的调节缓冲液的pH值, 离子强度以及洗脱液的pH值, 离子强度. 并综合利用多种层析方法(表3), 以达到最终抗原蛋白纯度要求[33-39].

表3 H. pylori抗原蛋白的纯化.

抗原蛋白	初步分离	纯化	结果	参考文献
Urease	离心→重悬→超速离心	凝胶过滤层析(Superose 12 HR 10/30柱, 缓冲液20 mmol/L磷酸盐和0.15 mmol/L NaCl, pH7.4)→过夜透析→阴离子交换层析(DEAE-5PW SpHerogel TSK-IEX柱, pH7.0, 20 mmol/L磷酸盐缓冲液)→ 500 mmol/L NaCl线性梯度洗脱	尿素酶回收率为80%, 当把细菌暴露在200-1000 mL/L的乙醇中时, 总酶活力达70%, 尿素能被浓缩112倍, 总回收率达13%	Dunn et al[54],1990
Urease	离心	DEAE-SepHarose层析→pHenyl-SepHarose层析→Mono Q层析→Superose 6层析	尿素酶能浓缩1070倍, 产量达25%	Todd et al[55], 1987
Urease	重悬→细菌破碎→离心除膜	DEAE-琼脂糖凝胶层析(1.5-7.5 cm)→ 23℃, 分阶段性用PHenyl-琼脂糖凝胶 (1.5-12 cm), Mono-Q(HR5/5), Superose 6(1.0-29.5 cm)	尿素酶浓缩17倍, SDS-PAGE检验只有一条条带	Hu et al[56],1990
Urease	离心→重悬→ 细菌破碎→ 离心除膜	DEAE-SepHarose柱层析→pHenyl-SepHarose柱层析→Mono-Q柱层析→ Superose 6柱层析	尿素酶吸光度2.0A	Hu et al[56],1990
Urease	离心→重悬→ 细菌破碎→超滤	离子交换层析(Source Q15离子交换柱), NaCl梯度洗脱	H. pylori阳性检出率100％(12/12), 阴性符合率100％(18/18). 特异性良好	白慕群 et al[57], 2000
VacA	离心→盐析→离心→重悬	疏水作用层析(pHenyl-Superose HR 5/5柱)→凝胶过滤层析(Superose 12 HR 16/50柱)→阴离子交换层析(Mono-Q HR 515柱, NaCl梯度洗脱)	3/4过三步层析后, 空泡毒素效价在24 000±5600, 浓缩倍数能够达到5333倍	Cover et al[58], 1992
VacA	离心→盐析→ 离心→重悬→微滤	凝胶过滤层析(Superose 12 HR 16/50或Superose 6 HR 16/50柱, 60 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, pH7.5)		Cover et al[58], 1992
VacA	离心→盐析→密度梯度离心	自动Densi-Flow IIC装置		Cover et al[59],1997
VacA	溶菌酶处理→超声波→离心	NiTEMTM树脂柱平衡后, 用混合液(50 mmol/L Tris, pH8.0, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Imidazole)洗脱 →离心		段秀杰 et al[50], 2006
VacA	盐析→离心→ 透析→离心	吸附层析→盐析→重悬→透析→疏水作用 层析(PHeny1-SepHarosc CL-4B柱)→阴离子交换层析(DEAE-E ScpHamsc FF柱, NaCl连续梯度洗脱→凝胶过滤层析→透析→离心→快速蛋白液相层析系统(FPLC)AKTA explorer-900	VacA蛋白浓度为0.125 mg/mL, 比活力达20 480, 与上清Ô液相比纯化倍数达4551, 产率为5 ug/L	杜奕奇 et al[60], 2002
CagA	离心	SepHadexG25凝胶过滤层析→阴离子 交换介质(High Q), 梯度洗脱	3/4生物电泳图象分析系统的密度扫描鉴定, 所得产物的纯度为90％	龚岷 et al[61], 2001
CagA	离心	金属螯合层析	3/4密度扫描鉴定, 这种方法所得产物的纯度为94.5%	龚岷 et al[61], 2001
CagA	用6 mol/L胍透析菌液	凝胶过滤层析		Ye et al[62], 2003
LPS	酶处理	辛基琼脂糖层析(用0.1 mmol/L醋酸钠, 0.5 mmol/L NaCl, pH4.7的缓冲液洗脱. 30%-60%的线性梯度洗脱) →PD-10脱盐柱, 2 g/L三乙胺平衡柱子		Yokota et al[63], 2007
LPS	苯酚-氯仿-石油醚处理→离心	上清液中脂多糖沉淀→离心		Slomiany et al[64], 2003
LPS	超声波→离心	抽提离心→透析→DNA和RNA酶作用→ 水浴→离心→上清加无水乙醇→离心→ 沉淀用蒸馏水悬浮→透析		严杰 et al[65], 1994

鉴于以上研究结果, 在对H. pylori大规模培养时, 多选用液体培养法, 可以用环糊精代替血清而提供营养. H. pylori重组表达后也可以获得大量高纯度的抗原蛋白(Urease、VacA、CagA和LPS), 此方法多选用质粒做载体, 大肠杆菌做受体菌, IPTG做诱导. 制备好抗原蛋白后, 我们可以采用离心、盐析、透析后层析(凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析和亲和层析)的方法纯化蛋白. 利用纯化的H. pylori抗原蛋白, 加合适的佐剂后多次免疫乳牛, 使其生产含抗H. pylori的特异性免疫球蛋白牛奶, 加工成乳制品. 人们通过饮用这种乳制品, 消除胃中的H. pylori, 来预防和治疗H. pylori感染.

评论

背景资料

利用幽门螺杆菌(H. pylori)的抗原蛋白制作疫苗, 免疫乳牛后, 能够生产抗H. pylori的免疫乳, 人饮用后, 可预防和治疗H. pylori感染, 为预防H. pylori感染提供新的思路, 避免药物副作用等.

同行评议者

白文元, 教授, 河北医科大学第二医院消化内科

研发前沿

利用乳牛生产抗H. pylori免疫乳, 抵抗人类H. pylori感染是一很好的思路, 在此过程中H. pylori疫苗制作最为重要, 有必要对H. pylori的培养和抗原蛋白的制备及分离纯化进行思考和研究.

创新盘点

本文系统性总结前人培养H. pylori的方法, 并提出液体培养法更能提高菌体产量, 并总结4种H. pylori抗原蛋白的制备和分离纯化的方法, 提出通过基因重组表达再利用各种层析方法获得高纯度蛋白.

应用要点

本文为H. pylori疫苗的制作奠定了基础, 同时为抗H. pylori免疫乳的生产开拓了道路.

名词解释

免疫乳: 给哺乳动物(主要指牛)选择性地接种一些能够引起人疾病的细菌、病毒或其他一些外来抗原刺激机体产生免疫应答, 以分泌特异性的抗体-免疫球蛋白, 并使其进入乳中, 这种乳称为免疫乳.

同行评价

本文思路清晰, 参考文献较新, 具有较好的学术价值.

备注

编辑:潘伯荣 电编:何基才

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