CuSO4对2.2.15细胞的影响

摘要

目的: 探讨硫酸铜(CuSO₄)对2.2.15细胞代谢及HBV复制和表达的影响及其机制.

方法: 采用MTT法检测CuSO₄对2.2.15细胞的毒性, 流式细胞仪检测细胞周期.透射电镜法, Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪观察CuSO₄对2.2.15细胞凋亡的影响, 采用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测不同浓度的CuSO₄作用后2.2.15细胞上清中HBsAg, HBeAg的P/N值, Taq man荧光定量PCR检测不同浓度CuSO₄作用后上清中HBVDNA滴度.

结果: MTT实验确定CuSO₄在培养液中对2.2.15细胞的最大无毒剂量是128 μmol/L.CuSO₄作用后可引起细胞周期的改变, 肝癌细胞被阻滞在G₂+M期, 且呈量效相关性.但是未发现CuSO₄有诱导凋亡的作用, CuSO₄干预12 d的结果显示2.2.15细胞上清中HBsAg, HBeAg 的滴度及HBVDNA的复制水平与对照组无明显差别.

结论: CuSO₄有明显的细胞毒作用, 可引起肿瘤细胞周期的改变及细胞坏死, 提示了铜的抗癌作用的分子机制, CuSO₄短期处理2.2.15细胞后暂未发现其对HBV复制和表达的影响.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 14, 2006
Revised: March 25, 2006
Accepted: April 8, 2006
Published online: May 15, 2006

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肝豆状核变性又称Wilsons病(WD), 是一种可以治疗的先天性铜代谢障碍的隐性遗传病, 病理基础是铜呈正平衡[1], 其肝铜浓度可达正常人的30-50倍, 多年的临床总结发现, 肝豆状核变性的患者中极少有HBV感染者, 而我国是乙肝高发区, 这种现象很难用巧合来解释, 因此大胆假设是否铜的高聚集可能影响乙肝病毒的感染, 研究肝病和铜关系近30 a的Sternlieb发现, Wilson病罕见有原发性肝癌的发生[2], 而血色病好发肝癌, 这种现象不能用Wilson病患者寿命短来解释, 而且Wilson病患者肝硬化发生比血色病早, 虽然铜的抑癌作用已被动物实验证实, 但铜与肿瘤关系的研究结果并不一致[3-6], 且其具体的抑癌分子机制也不清楚.为此, 我们利用2.2.15细胞, 就铜与肿瘤细胞及HBV的关系进行有关的探讨.

1 材料和方法

1.1 材料

2.2.15细胞和HepG2细胞由我室保存, DMEM、G418、胰酶、胎牛血清均购自GIBCO公司, MTT、RNA酶A和蛋白酶K均购自华美公司, DNAmarkers购自大连宝生物公司.Taq酶, dNTPs, PEG8000购自上海生物工程公司.FITC-Annexin V Apoptosis Detection Ｋit购自BioVision公司, 硫酸铜(CuSO₄)采用分析纯, 由中南大学湘雅二院药剂科配制为1%(M/V)的储存液备用.时间分辨荧光免疫分析仪及乙肝检测试剂盒由上海新波技术开发有限公司提供.HBV DNA定量检测采用美国Perkin Elmer公司的自动荧光定量PCR仪(PE5700型), 试剂采用中山医科大学达安公司的Taq man荧光定量试剂盒.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 2.2.15细胞用DMEM液培养, 培养液加100 mL/L胎牛血清, 0.03%(W/V)谷氨酰胺, 10⁵U/L青霉素, 10⁵U/L链霉素, 200 mg/L G418, 置37℃、50 mL/L CO₂孵箱中传代培养, 每4-5 d传代一次, 取对数生长期细胞用于试验.

1.2.2 MTT法检测CuSO₄对2.2.15细胞毒性: 取对数生长期2.2.15细胞, 用2.5 g/L胰酶分散细胞后计数, 调整浓度为5×10⁷/L, 置入96孔细胞培养板, 200 μL/孔, 待细胞贴壁后, 分别加入终浓度为512、256、128、64、32、16、8、4 μmol/L CuSO₄, 每组均含4个平行孔, 同时设不加药物的细胞对照组及空白组, 置50 mL/L CO₂孵箱内培养48 h, 结束前4-6 h, 每孔加入MTT(5 g/L)10 μL, 小心去除上清液, 加入DMSO 100 μL, 轻轻震荡至MTT沉淀完全溶解, 在多孔扫描分光光度计上, 测定570 nm波长下吸光度A值.取4孔A值平均数.

细胞杀伤率 = (对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%.

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期: 在已准备好的2.2.15和HepG2细胞瓶中加CuSO₄(浓度为128、64、32μmol/L, 并设不加药物的细胞组作为对照组), 另设一瓶不加药物为对照, 50 mL/L C0₂孵箱分别培养48 h, 用2.5 g/L胰酶将细胞消化脱壁, PBS洗涤2次, 用冷PBS制备成细胞悬液0.5 mL, 加5 mL 750 mL/L冷乙醇固定, 4℃过夜, 送北京鼎国生物技术有限公司用流式细胞仪检测细胞周期.数据用multicycle分析软件处理.

1.2.4 透射电镜观察细胞超微结构改变: 取状态良好的处于对数生长期的2.2.15细胞, 胰酶消化后, 按10⁹/L种板, 24 h后加入CuSO₄(浓度为128、64、32 μmol/L, 并设不加药物的细胞组作为对照组)作用48 h后, 收集细胞, 用PBS洗涤2次, 用2.5%戊二醛(V/V)、2%锇酸(W/V)固定, 脱水后用纯环氧树脂包埋, 超薄切片, 铅-铀双染色, 透射电镜下观察细胞超微结构并照相.

1.2.5 Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测细胞凋亡率: 细胞处理同上, 按FITC-Annexin V Apoptosis DetectionＫit操作, 进行流式细胞仪分析及激光共聚焦显微镜观察.

1.2.6 采用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测: 采用TRFIA检测不同浓度的CuSO₄作用后2.2.15细胞上清中HBsAg, HBeAg的P/N值.2.2.15细胞种40 mL培养瓶, 每瓶加5 mL培养基, 用时间分辨荧光免疫分析仪及乙肝检测试剂盒提供的说明书操作, 结果以实验孔A值/阴性对照孔A值(P/N)表示.

1.2.7 细胞上清病毒DNA的制备[4]: 取上述培养液, 每瓶5 mL, 1 000 r/min离心10 min, 收集上清, 加10%(W/V)PEG8000, 10 000 g离心10 min, 取沉淀, 重悬于TNE(10 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 100 mmol/L, NaCl, 1 mmol/L EDTA)中, 加蛋白酶K(200 μg/L), 55℃孵浴2 h, 常规苯酚氯仿抽提, 常规乙醇沉淀, 溶于50 μL TE中.-20℃保存备用.

1.2.8 Taq man荧光定量PCR检测CuSO₄作用后上清中HBVDNA滴度: 取上述各组DNA提取液2.2 μL加入PCR反应管中, 按说明书操作.

统计学处理 检测数据均采用mean±SD表示, 采用SPSS10.0版统计软件包进行方差分析.

2 结果

2.1 CuSO₄对2.2.15细胞有显著的细胞毒性, 且与剂量成正比, 512 μmol/L CuSO₄细胞杀伤率为100%, CuSO₄对细胞生长的半数毒性浓度(TC50)为256 μmol/L, CuSO₄在培养液中对2.2.15细胞的最大无毒剂量是128 μmol/L.

2.2 透射电镜观察未加铜处理的2.2.15细胞密集, 正常, 偶见线粒体轻度水肿和凋亡, 无坏死, 铜处理48 h后, 256 μmol/L浓度组镜下可见较多的细胞坏死和少量的凋亡, 128 μmmol/L及以下各浓度之间无明显差别, 结果均为:可见极少量坏死, 细胞器较好, 偶见线粒体轻度水肿, 空泡变, 偶见凋亡.以下的实验中我们均选择CuSO₄的浓度为128, 64, 32 μmol/L.

2.3 铜处理组流式细胞仪测定未见典型的凋亡峰, Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测结果显示对照组比较, 未见早期凋亡和晚期凋亡细胞.

2.4 流式细胞仪分析2.2.15细胞和HepG2细胞周期的结果见表1, CuSO₄作用48 h后S期和G1期变化不明显, G2+M期细胞数明显增加, 且呈量效相关性.上述现象在2.2.15细胞中更明显.

表1 流式细胞仪分析2.2.15细胞和HepG2细胞周期的结果.

	2.2.15 细胞(%)			HepG2细胞(%)
	G1	S	G2/M	G1	S	G2/M
对照组	65	27.1	7.9	56.5	23.7	19.8
128 μmol/L	36.8	30.0	33.1	54.1	16.8	29.1
64 μmol/L	44.4	31.5	24.1	55.0	19.7	25.3
32 μmol/L	54.0	17.6	28.3	65.1	12.2	22.7

2.5 CuSO₄作用后对2.2.15细胞HBV复制和表达的影响见表2, HBsAg, HBeAg的滴度在传代后逐渐上升, 7-10 d左右滴度最高, 12 d以后下降.对照组和处理组比较, P>0.05, 无统计学意义.上清HBVDNA结果显示:培养细胞长满瓶后其含量均可达到10¹⁰-10¹¹/L, 各组之间无明显的差异.

表2 CuSO₄作用后细胞上清HBsAg, HBeAg的滴度.

CuSO4浓度	HBsAg/HBeAg(P/N)
	2 d	4 d	7 d	10 d	12 d
128 μmol/L	2.72/0.67	5.06/0.78	11.54/1.61	12.80/2.31b	2.86/0.64
64 μmol/L	2.76/0.58	4.10/0.76	11.15/1.80	12.18/2.26b	2.17/0.59
32 μmol/L	2.61/0.56	5.18/0.68	11.43/1.92	13.11/2.17b	3.12/0.66
对照组	2.68/0.61	4.24/0.75	12.18/1.72	13.06/2.35	2.25/0.52

^bP<0.01 vs 对照组.

3 讨论

铜有很强的细胞毒性, 很高浓度的铜可导致肝细胞的迅速坏死, 本文结果显示, CuSO₄在培养液中对2.2.15细胞的最大无毒剂量为128 μmol/L, 且文献报道[7], 此浓度作用后细胞内CuSO₄的浓度与肝豆状核变性患者体内的肝铜含量相当, 故用其作为细胞模型, 同时发现此浓度以下处理细胞后, 可导致细胞周期改变, 肝癌细胞被阻滞在G2+M期, 且呈量效相关性.并未发现有诱导凋亡的作用.说明铜对肿瘤细胞的损伤, 首先表现为细胞周期的改变, 细胞阻滞在G2+M期, 进行有丝分裂前的修复, 提示如果长期处在高铜的恶劣环境中, 肿瘤细胞则难以存活.也为解释Wilson病患者肝硬化多见而肝癌少见的现象提供了依据.上述细胞阻滞现象在2.2.15细胞中更明显, 说明携带了HBV基因组的肝癌细胞更加脆弱, 更易受到毒性物质的伤害.

2.2.15 细胞以整和型HBVDNA分子为主, 细胞总HBVDNA含量的变化主要取决于细胞本身, 难以衡量2.2.15细胞内HBV的变化.为此, 我们选择上清中HBVDNA作为观察HBVDNA复制的指标, 同时确定了HBVDNA提取和定量检测的可行方法[8].2.2.15细胞表达产物用常规的ELISA乙肝两对检测试剂盒难以检测到, 我们采用时间分辨荧光免疫分析技术[9]检测上清中的HBsAg, HBeAg, 特异性强, 灵敏度高, 定量准确且范围广.

本实验干预12 d后的结果显示HBV的复制和表达水平均无明显差别.其可能的解释为(1)虽然既往的研究表明铜可导致核DNA的损伤[10-11], 但短期作用所造成的损害并不会直接影响到HBVDNA的复制和表达.(2)HBV感染的机制是复杂的, 可以作用的途径也是多方面的, 肝细胞的任何成分包括细胞膜, 细胞器都易受到高铜的损害, 产生功能和结构的改变, 文献[12]报道铜可引起细胞膜阴离子结合部位的转移, 从而影响细胞膜上的载体转运的结合部位.那么理论上铜的高聚集不仅可能影响HBV生存的宿主环境, 也可能影响HBV侵入肝细胞的过程.Wilson病患者的铜聚集是一个长期的过程, 而细胞培养中作用的时间较短, 此结果暂不能完全否定CuSO₄对HBV感染的影响.

备注

编辑:张海宁

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