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世界华人消化杂志. 2005-05-15; 13(10): 1202-1205
在线出版日期: 2005-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i10.1202
慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中 HBV cccDNA 预测拉米夫定的治疗效果
郭皓宇, 谭德明, 徐旭雯
郭皓宇, 谭德明, 徐旭雯, 中南大学湘雅医院感染病科 湖南省长沙市 410008
郭皓宇, 男, 1972-10-22, 湖南省沅江市人, 2002年中南大学湘雅医学院博士, 主要从事病毒性肝炎的研究.
通讯作者: 谭德明, 410008, 湖南省长沙市湘雅路87号, 中南大学湘雅医院感染科. guohaoyudf@tom.com
收稿日期: 2005-03-01
修回日期: 2005-03-15
接受日期: 2005-03-16
在线出版日期: 2005-05-15

目的: 探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗结束时, 外周血单个核细胞(PBMC)中HBV cccDNA(乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA)检测对拉米夫定持续应答的预测作用.

方法: 对慢性乙型肝炎患者17例进行拉米夫定治疗48 wk, 获得完全或部分疗效(血清HBV DNA转阴, ALT复常, 伴或不伴HBeAg血清转换), 48 wk治疗结束时检测PBMC中HBV cccDNA, 并对患者进行1年的血清HBVDNA监测.

结果: 治疗结束时PBMC中HBV cccDNA为阳性9例, 阴性8例.在PBMC中HBV cccDNA阳性者, 停止治疗的1年内所有患者的血清HBVDNA阳转.而PBMC中HBV cccDNA阴性者, 1例血清HBVDNA阳转.

结论: 拉米夫定治疗结束时PBMC中HBV cccDNA的检测可能对拉米夫定治疗能否获得持续应答具有预测价值.

关键词: 慢性乙型肝炎; 乙型肝炎病毒; 共价闭合环状DNA; 外周血单个核细胞; 拉米夫定
引文著录: 郭皓宇, 谭德明, 徐旭雯. 慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中 HBV cccDNA 预测拉米夫定的治疗效果. 世界华人消化杂志 2005; 13(10): 1202-1205
Predictive value of HBV cccDNA in PBMC of response to lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B
Hao-Yu Guo, De-Ming Tan, Xu-Wen Xu
Hao-Yu Guo, De-Ming Tan, Xu-Wen Xu, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Correspondence to: Dr De-Ming Tan, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hosipital, 87 Xiangya Road, Changsha 410078, Hunan Province, China. guohaoyudf@tom.com
Received: March 1, 2005
Revised: March 15, 2005
Accepted: March 16, 2005
Published online: May 15, 2005

AIM: To assess the value of hepatitis B virus (HBV) covalently closed circle DNA (cccDNA) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) for the prediction of the sustained response to lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B.

METHODS: Seventeen chronic hepatitis B patients with complete or partial response (serum HBV DNA turned negative, and ALT was normalized with or without HBeAg/anti-HBe seroconversion) were selected. HBV cccDNA in PBMC was detected at the end of lamivudine treatment, and 1 year after treatment.

RESULTS: Nine out of 17 patients were positive for HBV cccDNA in their PBMC at the end of lamivudine treatment. Virological relapse were found during 1-year follow-up in all of these 9 patients; whereas only 1 relapse was observed among the 8 patients without HBV cccDNA.

CONCLUSION: HBV cccDNA in PBMC at the end of treatment is of good predictive value for the sustained response to lamivudine treatment in chronic hepatitis B patients.

Key Words: Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus; cccDNA; Peripheral blood mononuclear cells; Lamivudine
0 引言

拉米夫定是目前治疗慢性乙型肝炎的最常用的药物之一.拉米夫定具有很强的抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus;HBV)作用, 临床应用后大多数患者血清HBV DNA滴度明显下降或阴转, 但中止治疗后易出现复发, 特别是在未取得完全应答疗效的患者[1-3].如何减少拉米夫定停药后复发的机会, 提高持续应答率一直是临床研究者关注的问题.尽管目前对拉米夫定治疗应答相关因素进行了较多的研究, 但尚未发现能确切预测患者能否获得持续应答的指标.拉米夫定对细胞内HBV cccDNA无直接的抑制作用, 细胞内HBV cccDNA存在被认为是拉米夫定停药后复发的主要原因[4-6].因此, 拉米夫定治疗结束时PBMC中HBVcccDNA的检测可能对拉米夫定的治疗后的持续应答效果有预测价值.

1 材料和方法
1.1 材料

接受拉米夫定治疗48 wk时取得完全或部分应答(即血清HBVDNA转阴、ALT复常、伴或不伴HBeAg/抗HBe血清转换)的慢性乙型肝炎患者17例, 男14例, 女3例, 年龄22-35岁, 诊断均符合2000年西安会议"病毒性肝炎诊断标准"[7], 以及符合拉米夫定的用药指征[8].治疗48 wk后患者因用药有效而要求停止服药.停药后随访1年, 随访方案参照《2001年拉米夫定临床应用专家共识》[8]:停药后的前3 mo每月1次, 以后每3-6 mo 1次, 随访时检验肝功能、HBV血清标志物和血HBVDNA、以及PBMC中的HBVcccDNA.

1.2 方法

取肝素抗凝全血, 以Ficoll密度梯度离心法获取PBMC;加入裂解液(50 μL/106cells, 上海申友公司提供), 煮沸10 min, 14 000 g离心10 min, 取上清2 μL;采用实时荧光PCR法检测HBVcccDNA.实时荧光PCR法由邵俊斌et al建立的巢式PCR方法进行[9].第1次PCR以嵌合引物(含HBV非特异和特异性序列), 以HBV DNA正链为模板通过常规PCR(PCR条件:15 cycles 94℃ 20 s, 50℃ 20 s, 72℃ 45 s)合成特异性的单链产物;第2次PCR以单链产物为模板, 利用设计的特异性引物及探针通过荧光定量PCR(PCR条件:95℃ 15 min, 35 cycles 93℃ 10 s, 62℃ 30 s.)扩增HBVcccDNA, 定量结果从荧光定量PCR仪(Bio-red PCR仪)上直接读出.

统计学处理 数据利用SPSS软件进行统计学处理, 应用χ2检验.

2 结果
2.1 PBMC中HBV cccDNA检测的结果

HBVDNA阳性(HBVDNA<1012copies/L时)的血清标本检测呈阴性, 而含HBV全基因双链DNA的质粒DNA检测呈阳性(图1).说明成熟的基因组HBV DNA在本PCR反应体系中不能被扩增, 证明了本HBV cccDNA扩增体系具有较高的特异性.拉米夫定治疗48 wk结束时, 均已取得了完全或部分应答的17例慢性乙型肝炎患者的PBMC, 经检测HBV cccDNA阳性9例, 阴性8例(图2).

图1
图1 应用实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA结果(阳性: 曲线超过桔红色基线以上; 阴性: 曲线未达到桔红色基线). A: 质粒DNA(阳性对照); B: 阴性对照; C: 血清HBV DNA阳性患者PBMC DNA; D: HBV DNA阳性血清.
图2
图2 17例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA检测情况. A: 实时荧光定量PCR扩增曲线示意图: 共22条曲线, 分别为: 3份阳性标准定量标本(质粒DNA, 分别为2×106, 105, 104 copies), 17份PBMC标本, 1份HBV DNA阳性血清标本, 1份阴性对照;其中曲线在基线之上者12条(阳性), 在基线之下者10条(阴性).B: 实时荧光定量PCR标准曲线示意图: 此曲线显示了所有阳性产物的Ct值(线上的点即代表Ct值, Ct值对应着一个产物的copy数; 蓝点为已知标本; 红点为待测标本. 如图所示, PBMC中HBV cccDNA阳性的标本, 其滴度基本上集中在10-3copies/cell左右.
2.2 PBMC中HBVcccDNA与拉米夫定停药后复发的关系

PBMC中检出了HBVcccDNA阳性患者9例, 随访中有全部复发, 其中3 mo时复发3例;6 mo时复发8例;随访1年时, 全部患者的血清HBVDNA阳转, 伴有ALT升高7例.8例PBMC中未检出HBVcccDNA者, 1例患者于停药后6 mo血清HBVDNA阳转, 但ALT正常(P<0.01).

2.3 PBMC中HBVcccDNA与HBeAg/抗HBe血清变化的关系

拉米夫定治疗48 wk时, HBeAg阳性者6例, PBMC中HBV cccDNA阳性5例;而7例抗HBe阳性患者的PBMC中HBV cccDNA仅1例;PBMC中HBV cccDNA与血清HBeAg阳性有伴随关系(P<0.05).

3 讨论

治疗慢性乙型肝炎的关键措施是抗病毒治疗.目前已批准使用的抗病毒药物中最常用的是干扰素与拉米夫定.拉米夫定抑制HBV复制的作用迅速而确切, 但过早停药, 或未取得HBeAg/抗HBe血清转换的情况下停药, HBV再次复制活跃, 血清HBV DNA再次阳性, 以及由此导致的肝炎复发率较高.拉米夫定停药后易复发的原因可能与药物对HBV复制的关键中间体HBV cccDNA无直接的抑制作用, 因此, 拉米夫定治疗有效后血清HBV DNA阴转, 但感染的细胞内HBV cccDNA很可能仍然阳性, 成为拉米夫定停药后HBV再次复制活跃的来源.HBV cccDNA存在于HBV感染的人体细胞内, 主要是肝细胞, 其次是外周血单个核细胞(PBMC)[10-11].我们应用实时荧光PCR检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBVcccDNA, 取得了较好的效果.在拉米夫定治疗48 wk后, 17例患者尽管血清HBV DNA均阴性, 但有9例患者PBMC中可以检出低水平的HBV cccDNA.似乎表明拉米夫定对HBV cccDNA抑制作用较差, 血清HBV DNA阴转不能代表细胞内HBV DNA被清除.一些体外试验的结果表明拉米夫定对HBV cccDNA无抑制作用[4,12-13], 但我们发现17例患者治疗后有8例PBMC中HBVcccDNA呈阴性, 9例阳性者其HBVcccDNA滴度也不高, 这有可能是拉米夫定的长期应用, 通过间接的作用, 减少和消耗了细胞中的HBVcccDNA, 使其滴度下降和阴转, 这提示经过长期的抗病毒治疗是有可能清除体内的HBV.

对17例经拉米夫定治疗取得初步疗效而停药的患者进行1年的随访研究(拉米夫定治疗后肝炎复发绝大部分发生在停药后的1年中[8]).有10例患者血清HBVDNA再次阳性, 复发率58.8%.在复发的10例患者中, 停药时PBMC中有9例检出HBVcccDNA.由此可见, HBVcccDNA确与拉米夫定停药后病毒再次复制活跃有关, 甚至可能即为复发的来源.从另一个角度讲, 对停药时PBMC中HBVcccDNA的检测也可能有助于医师对停药后复发可能性的预测.在拉米夫定临床应用专家指导意见中[8], 强调了HBeAg/抗HBe血清转换对持续应答的重要性.从本结果来看, 确实是发生了HBeAg/抗HBe血清转换的患者其停药后复发率(1/7, 14.3%)明显地低于未发生HBeAg/抗HBe血清转换患者的复发率(6/7, 85.7%);PBMC中HBVcccDNA的检出率(1/9, 11.1%)明显地低于未发生HBeAg/抗HBe血清转换患者的检出率(8/9, 88.9%).此外, 尽管HBeAg/抗HBe血清转换对抗病毒停药后的复发能起到较好的预见作用, 但仍有一些已发生HBeAg/抗HBe血清转换者停药后复发的例子[14].我们也观察到, 发生了HBeAg/抗HBe血清转换者中, 有1例PBMC中检出了HBV cccDNA, 这例患者在停药1年内复发.因此, 在观察HBeAg/抗HBe血清转换的同时, 监测PBMC中HBV cccDNA, 可能更好地帮助临床医师预测拉米夫定停药后复发地可能性, 指导医师更合理地应用拉米夫定及其他抗病毒药物治疗.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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