大鼠肝脏缺血再灌注损伤中谷氨酰胺对HSP70表达的影响

摘要

目的: 探讨谷氨酰胺(glutamine, Gln)对肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)时肝组织热休克蛋白70(HSP70)表达的影响.

方法: ♂Wistar大鼠48只随机分为谷氨酰胺组(G组)及对照组(C组), 谷氨酰胺预处理后建立HIRI模型(以Pringle法阻断入肝血流30 min), Western blotting法检测再灌注后肝组织HSP70表达, 并检测血清ALT, LDH水平以及肝组织病理学改变.

结果: 两组肝组织于再灌注后1 h均仅有微量HSP70表达, 再灌注后24 h HSP70表达明显增强并持续至48 h, 但各时点G组HSP70表达水平明显低于C组; G组血清ALT, LDH水平再灌注后1, 24 h均显著低于C组(1 h: ^aP <0.05, ^bP <0.01; 24 h: ^bP <0.01), 且两组肝酶水平再灌注后24 h均较再灌注后1 h有显著恢复.肝组织损害的病理学改变G组亦明显轻于C组.

结论: Gln对HIRI具有保护作用并能下调HIRI时肝组织中HSP70表达.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: August 17, 2004
Revised: August 21, 2004
Accepted: August 25, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)是肝移植和肝脏外科所面临的一大难题. 入肝血流完全阻断是肝脏外科术中常用的控制出血的方法, 但其可引起门静脉系统(尤其是肠道)淤血, 肝脏恢复血供后淤滞门静脉血再灌注势必造成肝脏再灌注损伤. 谷氨酰胺(Gln)作为条件必需氨基酸, 对多种器官和组织细胞具有独特而重要的代谢功能, 并可维持肠道结构和屏障功能, 减轻内毒素等对肠道的损伤以及增强HSP70的表达[1-3]. 热休克蛋白70(HSP70)是HSP家族的主要成分, 是机体受到应激后产生的蛋白质, 其大量表达可提高细胞的应激能力, 抵御各种有害因素的损伤[1,4-9]. 目前对Gln在HIRI中的作用以及对肝组织HSP70表达影响的研究尚未见报道. 我们应用大鼠HIRI模型, 探讨术前应用Gln对HIRI的作用以及对肝组织HSP70表达的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

健康♂Wistar大鼠, 体质量200-300 g, 由中国医科大学附属第二医院动物实验中心提供. 丙氨酰-谷氨酰胺二肽 (力肽), 购自德国费森尤斯中国华瑞制药有限公司. HSP70抗体及碱磷酶标记马抗小鼠 IgG(H+L)均购自北京中山生物技术有限公司.大鼠静脉输液模型的建立: 参照中国人民解放军第三军医大学静脉营养模型[10]. 大鼠术前禁食12 h, 100 g/L乌拉坦按0.1 mL/kg ip麻醉. 模型建立后将大鼠置于代谢笼中, 允许自由活动, 常规进食. 插管后2 h始用微量泵持续输注生理盐水(速度为2 mL/h), 观察3 d. 48只大鼠随机分为两组, 即Gln组(G组)和对照组(C组), 各组24只. G组给予Gln溶液, C组给予生理盐水, 输液速度为2 mL/h, 共3 d, 输液期间常规进食. 第7 d麻醉成功后, 将大鼠置于电热毯上以保持体温在36.5±0.5 ℃. 局部备皮, 消毒, 取正中切口入腹, 离断肝周韧带, 以消除肝脏侧支循环. 用无创伤微血管夹完全阻断门静脉、肝动脉及胆总管(Pringle法), 肝脏持续缺血30 min后松开血管夹, 松动肝门恢复肝血供, 关腹.于再灌注后1, 24及48 h抽3 mL腹主动脉血, 随即用预冷镊子快速夹取一块肝组织, 用锡箔纸包裹置于液氮中保存, 再转至-80 ℃冰箱中保存, 待测HSP70表达;于再灌注后1, 24 h取1 cm×1 cm×0.5 cm大小肝组织, 置于40 g/L甲醛溶液中固定, 备作病理学检查. 血液静置20 min后, 离心10 min (2 500 r/min), 用微量移液器将上清液移至预冷弹头中, 置于-30 ℃冰箱中冷冻保存, 待测生化指标. 处死大鼠.

1.2 方法

用全自动生化分析仪测定动脉血清谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)水平. 肝组织块切片后常规HE染色并行光镜观察. Western Blotting法测定肝组织HSP70表达[11].

统计学处理 计量资料用统计软件SPSS11.5进行t检验, 结果用mean±SD表示, P<0.05被认为有统计学意义.

2 结果

2.1 血清肝酶水平

肝脏缺血再灌注后, 两组间血清肝酶水平明显不同. 再灌注1 h, G组血清ALT, LDH水平均显著低于C组(P <0.05; P <0.01); 再灌注24 h, 两组血清ALT, LDH水平均较本组再灌注1 h显著下降, 且G组显著低于C组(P <0.01, 表1).

表1 大鼠血清ALT, LDH水平(mkat/L, mean±SD, n=8).

分组	处理	ALT		LDH
		再灌注1 h	再灌注24 h	再灌注1 h	再灌注24 h
G组	Gln	8.3±2.0a	2.9±2.5b	116.0±40.7b	6.9±3.6b
C组	NS	13.7±5.5	9.1±4.3	195.3±49.9	32.6±11.5

^aP <0.05,

^bP <0.01 vs C组.

2.2 病理形态学改变

肝脏缺血再灌注后1 h, G组肝细胞仅有轻度肿胀, 少量脂肪变性; 而C组肝细胞则明显肿胀, 胞质内脂肪及空泡样变性较重, 肝窦腔隙明显变窄或消失, 窦内可见大量红细胞, 局部有炎症细胞浸润, 肝包膜下可见出血(图1). 再灌注后24 h, G组肝细胞肿胀变性略有加重, 但肝脏结构尚规整, 局部有点状坏死, 可见核分裂相; 而C组肝脏结构紊乱, 可见片状肝细胞坏死.

图1 再灌注后1 h肝脏病理组织学改变HE×100. A: G组肝组织结构尚规整, 肝细胞轻度肿胀变性; B: C组肝脏结构明显紊乱, 肝细胞明显空泡变性.

2.3 肝脏组织HSP70表达

再灌注1 h, 两组肝组织内HSP70均只有轻微表达. 再灌注24 h, C组HSP70表达明显增强, 持续至再灌注48 h仍维持于高水平; G组再灌注24 h肝脏HSP70表达亦有轻度增强并维持至再灌注48 h, 但水平明显低于C组(图2).

图2 再灌注后肝组织HSP70的表达.

3 讨论

肝脏缺血再灌注损伤的防护是肝移植和肝脏外科的难点和热点. 目前常用的防护方法有缺血预处理、低温低氧预处理、药物预处理等, 其中药物预处理是较为热门的防护HIRI的方法, 但至今仍无一种药物能有效地防护HIRI. 谷氨酰胺(Gln)作为条件必需氨基酸, 在肠道、心肌及骨骼肌的缺血再灌注损伤过程中具有保护作用[1,12-20]. 在内毒素休克等应激时补充外源性Gln有利于HSP70表达增强[1,21-22]. 肝脏缺血再灌注后HSP70表达水平、持续时间与应激方法和肝脏病理状态有关, 并在一定范围内HSP70随肝脏损伤程度的加重而表达增强, 随损伤的修复而逐渐消退. HSP70被认为是肝缺血再灌注时肝脏损伤严重程度的敏感指标之一[23-24]. 但目前就Gln在HIRI中的作用以及对肝组织HSP70的表达的影响仍不得而知, 因此通过建立HIRI模型对此进行初步探讨. 我们发现, 肝脏缺血再灌注后不同时点G组血清ALT, LDH水平均显著低于C组, 而且肝组织病理学改变G组亦较C组明显减轻; 两组肝组织再灌注后1 h HSP70均只有轻微表达, 再灌注后24 h HSP70表达均增强并持续至再灌注48 h 仍维持于高水平, 但G组HSP70表达水平明显低于C组.

再灌注后G组血清酶水平和肝组织病理学损害程度均显著低于C组, 说明术前给予Gln能够减轻HIRI. 再灌注后1 h两组肝组织HSP70均只有轻微表达, 原因在于健康肝脏单纯长时间缺血并不能激活HSP70基因, HSP70mRNA只有在肝脏发生缺血再灌注区才有表达, 而在非缺血区则无表达[24-25]. 并且HSP70多于再灌注后6 h左右才有表达增强, 于再灌注24- 48 h达高峰[23,26-27], 这与本实验结果一致. 但本研究G组HSP70表达水平反而明显低于C组, 与肠道等脏器内毒素休克时应用Gln可增强HSP70表达的结果不一致[1,21-22]. 其原因可能为: Gln作为肠道细胞的主要代谢燃料, 术前给予可维持入肝血流完全阻断门静脉系统淤血时小肠黏膜细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的代谢和功能, 促进肠黏膜细胞分裂增生, 加快上皮增生与修复, 保护肠黏膜屏障; 并且Gln可增强肠黏膜细胞HSP70表达, 提高其应激能力, 减轻肠道淤血的损伤, 减轻肠道细菌及内毒素易位, 进而抑制了淤滞的门静脉血再灌注对肝脏枯否氏细胞的激活, 抑制了TNF-α, IL-1等细胞因子的释放和氧自由基、活性氧族的产生, 从而减轻了对肝脏的损伤[14,15,18,28-30], 因此与C组相比相对减少了肝脏HSP70基因的激活, 使肝组织HSP70表达水平下降.亦说明HSP70表达水平可以在一定程度上反映缺血再灌注时肝脏的损伤程度.

总之, 术前给予Gln对HIRI具有保护作用, 并能下调肝组织HSP70的表达, 但其调控机制仍有待进一步研究.

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备注

$[Footnotes]