三氧化二砷对鸡胚移植胆管癌生长的抑制作用

摘要

目的

探讨三氧化二砷(As₂O₃)对鸡胚移植胆管癌生长的抑制作用及其机制．

方法

建立胆管癌QBC₉₃₉细胞株鸡胚移植模型, 接种癌细胞后9 d切取标本, 比较As₂O₃作用组和对照组肿瘤生长、血管生成情况, 原位末端标记法检测肿瘤组织细胞凋亡, 免疫组化检测核增生抗原(PCNA)与血管内皮生长因子(VEGF)的表达．

结果

As₂O₃作用组肿瘤生长和血管生成受到抑制, 细胞凋亡增多、PCNA和VEGF表达减弱．

结论

As₂O₃有抗胆管癌的作用．其机制与诱导细胞凋亡, 抑制癌细胞增生、癌组织VEGF表达以及肿瘤血管生成有关．

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 24, 2002
Revised: January 15, 2002
Accepted: February 17, 2003
Published online: June 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

胆管癌对目前的化疗药物常常敏感性欠佳[1]. 近年我国在三氧化二砷(As₂O₃)治疗白血病方面取得重大突破, 疗效好而副作用少[2]; 对其他如食管癌[3]、大肠癌[4]等实体瘤也有效．本实验以胆管癌鸡胚移植模型观察As₂O₃对胆管癌生长的抑制作用．

1 材料和方法

1.1 材料

胆管癌QBC₉₃₉细胞株, 由王曙光教授建株[5]; As₂O₃由哈尔滨伊达药业有限公司提供; SABC免疫组化试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司; PCNA、VEGF抗体系Santa Cruz公司产品． 实验用胚蛋购自第三军医大学微生物教研室．

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 QBC₉₃₉细胞, 接种于含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和100 mL/L灭活小牛血清的新鲜RPMI-1640培养液中, 37 °C、50 mL/L CO₂培养箱中培养, 6 d传代一次. 实验采用指数生长期的细胞．

1.2.2 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的制备[6] 胚蛋孵育至7 d时, 在照卵灯下寻找胚头, 约在胚头右下方0.5-1 cm处划定约0.51.5 cm²的开窗位置. 在鸡蛋气室端钻1-2 mm的小孔并穿透气室壳膜. 在蛋壳开窗位置用小砂轮磨切开窗, 吹去蛋壳上磨切的粉尘, 75 mL/L乙醇消毒, 揭去开窗处的蛋壳．用橡皮吸头从气室小孔轻轻吸气使绒毛膜下沉. 用虹膜刀切破壳膜, 暴露出CAM. 暴露已制备好的CAM, 进行实验干预．

1.2.3 鸡胚接种与药物干预 选择生长良好的胚蛋45只, 接种癌细胞后随机分3组: PBS组、As₂O₃作用组、顺铂(DDP)作用组. 接种方法: QBC₉₃₉细胞用RPMI-PBS稀释, 接种量6106/0.1 mL. 鸡胚开窗后立即接种于CAM相对无血管区. 接种后第3天将浸有As₂O₃或DDP的玻璃滤纸放置于癌细胞接种部位, As₂O₃和DDP按血药浓度2倍稀释[7], 分别为2 μg/Ml和4 μg/mL; 对照组用0.01M PBS浸泡的滤纸. 每日更换一次滤纸, 严格无菌操作． 封窗后放入孵化箱, 观察肿瘤生长和血管生成情况. 接种后第9天取材, 测量肿瘤大小, 肿瘤组织HE染色观察．

1.2.4 免疫组化指标的检测 标本用4 mL/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋. 切片脱蜡至水. 按SABC操作步骤(枸橼酸盐抗原热修复)检测PCNA、VEGF的表达. 根据阳性细胞的百分率分为4个等级: 0分(无阳性细胞), 1分(阳性细胞<30%), 2分(阳性细胞30-70%), 3分(阳性细胞>70%); 阳性细胞染色强度也分为4个等级: 0分(无阳性细胞), 1分(浅黄色), 2分(黄色), 3分(棕黄色); 将2者评分相加后除以2得出VEGF表达的综合评分. 高倍镜下随机选择至少2个视野计数1 000个细胞核黄色细胞, 计算出PCNA表达的阳性细胞百分数．

1.2.5 凋亡TUNEL检测 切片脱蜡至水. 按TUNEL操作步骤检测组织凋亡细胞．细胞核染色紫蓝色颗粒者(碱性磷酸酶)为凋亡细胞. 计算阳性细胞百分数同PCNA计算方法．

统计学处理 采用SPSS 8.0进行统计分析. 测定结果以mean±SD表示, 采用t检验和x²检验, P<0.01为有统计学意义．

2 结果

2.1 鸡胚模型的大体观察

接种癌细胞后1-3 d, 瘤体生长缓慢, 3 d后, 生长迅速, 瘤体明显增大; 至第7天, 瘤体最大径可达9 mm左右; 其后肿瘤生长减慢. 癌细胞种植成功率达100%. 接种癌细胞3 d后, 血管辐凑现象明显, 与肿瘤诱导血管生成作用有关．早期瘤组织HE镜检见癌细胞体积减小, 间质少; 4 d后可见癌组织形成巢状腺腔样结构, 并且有新生血管形成(图1). 肿瘤周围血管As_2O3组比PBS组细而少．

2.2 肿瘤生长的比较

接种癌细胞第9天采集标本, 测量大小(直径)如下: PBS组5.8±1.21 mm, As2O3组2.6±0.7 mm, DDP组2.8±0.5 mm. PBS组与As_2O3组差异显著(P<0.01), As_2O3 组与DDP组比较差异不显著(P>0.05)．

2.3 VEGF 和PCNA的表达

TUNEL检测凋亡结果, 见表1.

表1 免疫组化和凋亡检测结果(mean±SD).

实验分组	n	VEGF	PCNA	凋亡指数
PBS组	10	2.06±0.46	48.88±5.33	4.11±1.9
As2O3组	10	1.33±0.43	24.66±4.21	32.22±5.4

P<0.01, As_2O3 组 vs PBS组.

3 讨论

胆道癌起病隐匿、根治困难、预后很差. 手术与非手术治疗5 a生存率<12%, 胆道癌的根治主要依赖手术[1,8,9]. 放化疗和介入等综合治疗措施有助于提高总体治疗效果, 目前多数学者认为化疗对胆道肿瘤有一定效果[1,10-12], 因此有必要探索新的化疗药物．

As_2O3已经成功的应用于实体肿瘤化疗的实验研究． 经As_2O3作用的移植胆管癌生长受到显著抑制. 本组资料采用滤纸给药的方式, 局部浓度高, 与临床常用的肝动脉灌注化疗相似．一般认为As_2O3的抗癌机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关[2,3]. 实验研究结果与文献报道一致, As_2O3作用组癌细胞凋亡显著, 而对照组凋亡细胞少见; 同时发现癌细胞核增生抗原表达减弱, 推测与As_2O3阻滞癌细胞周期有关．

在实体瘤, 肿瘤的增长有赖于新生血管的生长和内皮细胞的增生[13], 肿瘤细胞与血管内皮细胞之间相互促进, 分泌细胞增生因子, 此过程内皮细胞的增生依赖肿瘤微环境促进增生与诱导凋亡信号刺激的平衡[14]．经As_2O3作用的胆管癌组织细胞凋亡增加, 生长受到抑制, 癌组织中刺激内皮细胞增生的VEGF表达明显减弱, 与文献[15]报道结果一致; 大体观察As_2O3作用组癌组织周围辐辏血管较PBS组稀少, 认为As_2O3具有抑制肿瘤血管生成的作用, 进而抑制肿瘤的生长．

总之, As_2O3能够有效抑制鸡胚移植胆管癌的生长, 其抗癌作用与诱导癌细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成有关. 有必要进一步研究并应用于临床．

备注

$[Footnotes]

参考文献

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